Karel Šlais (Počátky a historie ČS HPLC)

Karel Šlais se narodil 18. prosince 1948 v Praze. Absolvoval SPŠCH v Brně a tehdy Univerzitu J.E. Purkyně (1968 ‐ 1973), nyní Masarykovu univerzitu v Brně, obor organická chemie. Od r 1974 je zaměstnán v Ústavu analytické chemie AV ČR v Brně, kde stál u počátků oddělení kapalinové chromatografie vedeném M. Krejčím. Věnoval se zejména miniaturizaci kapalinové chromatografie a elektrochemické detekci což byla hlavní témata kandidátské disertace (1979), ročního stipendijního pobytu na Ústavu analytické chemie Vídeňské univerzity, J.F.K.Huber, (1980) a dalších let. V roce 1986 absolvoval půlroční stáž na Free University Amsterdam, R.W.Frei, kde se zabýval použitím gradientové eluce a předkolon v kapalinové chromatografii. V roce 1992 obhájil doktorskou disertaci na téma elektrochemická detekce v kapalinové chromatografii. V roce 1993 byl jmenován vedoucím oddělení kapalinových separačních metod na UIACH AV ČR. Jeho zájem se postupně orientoval na fokusační elektromigrační metody včetně vývoje standardů pro izoelektrickou fokusaci. Je autorem a spoluautorem více než 100 publikací v zahraničních impaktovaných časopisech.

Jak jste tehdy mohli dělat vědu bez internetu?

Student PGS, 2005

POČÁTKY VYSOKOÚČINNÉ KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE V BRNĚ

Kapalinové chromatografii je v podstatě přes sto let (např. Smolková) (1). O vysokoúčinné kapalinové chromatografii – či HPLC podle zkráceného anglického termínu high performance liquid chromatography se začíná ve světě mluvit od konce 60. let minulého století, viz např. přehled (Švec) (2).

V Brně se nástup této metody podařilo zachytit iniciativou J. Janáka, zakladatele a ředitele tehdejšího Ústavu instrumentální analytické chemie ČSAV (UIACh), který pověřil M. Krejčího a jeho skupinu, aby se touto metodou zabýval. Tato skupina se konstituovala jako oddělení 6. 2. 1974, kdy se statut ústavu změnil na Ústav analytické chemie ČSAV (zkratka UIACh přetrvává dodnes). V té době měl celý ústav 11 vědeckých, 4 vědecko‐technické, 9 odborných a 10 technických pracovníků a dále řadu aspirantů, studijních pobytů a diplomantů. Další detaily lze nalézt např. v ročence (3) k 20 letům vývoje Ústavu analytické chemie ČSAV.

Tato kniha vznikla za vzájemné spolupráce České společnosti pro hmotnostní spektrometrii, české pobočky firmy Thermo Fisher Scientific a firmy Pragolab. Vydání bylo realizováno za sponzorského přispění firem Thermo Fisher Scientific a Pragolab.

ČSHS: Česká společnost pro hmotnostní spektrometrii, česká pobočka firmy Thermo Fisher Scientific, firma Pragolab.

Do UIACH jsem se dostal v r. 1971 jako tzv. pomocná vědecká síla ve 4. ročníku na Katedře organické chemie UJEP v Brně. Pod vedením M. Kratochvíla jsem se tehdy podílel na výzkumu chlorace tetrahydrofuranu. Reakční produkty byly sledovány zejména plynovou chromatografií, avšak výsledky byly stále nepřehledné. Vadila zvýšená teplota při plynové chromatografii, která způsobovala rozklad reakčních produktů. M. Kratochvíl navrhl, abych se na problém podíval kapalinovou chromatografií, kterou dělali naproti přes ulici u Janáků, jak se tehdy UIACh říkalo. Absolvoval jsem přijímací pohovor u J. Janáka a dostal za úkol prostudovat klíčové práce o HPLC, samozřejmě v angličtině, a do týdne mu o nich referovat. Zdá se, že jsem to zvládl, a pak mě uvedl do skupiny M. Krejčího.

BOD NULA

U podmínek a stavu výzkumu HPLC v Brně počátkem 70. let se trochu zdržím, z dnešního pohledu to spíš připomíná alchymii. Kapalinová chromatografie se dělala v tzv. velké laboratoři. V jedné velké místnosti bylo 7 lidí s psacími stoly a veškerou instrumentací, viz rohová místnost v 1. patře rohu dnešní Kounicova (2 okna) a Nerudova (1 okno).

ČSHS: Obr. 1 - Budova, ve které sídlil starý ústav UIACh v přízemí a 1. patře rohu dnešních ulic Kounicova a Nerudova.

Na škole se o HPLC nic nevědělo, avšak v praktikách biochemie jsem se setkal s tenkovrstevnou chromatografií a amino‐analyzátorem. Díly tohoto instrumentu, který zahrnoval i části jako čerpadlo, detektor, zapisovač české výroby jsem viděl i na UIACh. Klíčem HPLC na UIACh byly tehdy nerezové kolony o vnitřním průměru 2 mm, délky 50 cm, (Obr. 2 nahoře na stojanu vlevo), ručně za sucha plněné hlavně silikagelem tříděným sítováním.

ČSHS: Obr. 2 - Autor u drátového transportního detektoru. V pozadí nahoře na stojanu kolona s dávkovačem a předkolona.

Plnění probíhalo poklepáváním kolony a pomalým přidáváním sorbentu po několik hodin. Ucpávky kolon byly z filtračního papíru a skleněné vaty. Průměr částic byl 20 – 40 mikrometrů. Mobilní fáze na bázi uhlovodíků byly regenerovány destilací ve skleněné aparatuře a sušené molekulárním sítem, regenerovaným žíháním v muflové peci. Vysokotlaká čerpadla byla pulzní, plunžrová nebo membránová, a proto tok musel být vyhlazen tlumičem rázů zhotoveným ze série manometrických trubic. Před separační kolonou byla sušící předkolona, sušila mobilní fázi na bázi uhlovodíků (Viz Obr. 2 – nahoře vpravo na stojanu). Vzorek se na kolonu dávkoval přes septový dávkovač (Obr. 2 nahoře vlevo) za použití vysokotlakých stříkaček. Ty byly drahé a netěsnily. Každý experimentátor měl nastavenou svou stříkačku ke svému dávkovači. Záměna k jinému chromatografu vedla ke spolehlivému ucpání vlivem vniknutí jehly do náplně kolony. K propojování dílů chromatografu se používaly mosazné fitinky vyrobené v ústavu. Nejčastěji používaným detektorem byl právě takový jako v aminanalyzátoru, t.j. UV detektor na 254 nm s příčně svícenou křemennou kapilárou. Signál z detektoru se vedl na registrační milivoltmetr s inkoustovým pisátkem, které nikdy pořádně nepsalo. Spotřeba registračního papíru byla značná už proto, že každý typ milivoltmetru potřeboval jiný papír. Podstatná část experimentu spočívala ve vyčerpávajícím boji s nulovou linií, která kolísala zejména v důsledku nedokonalého odplynění mobilní fáze. Když byly získány chromatogramy, vyhodnocovaly se za použití tužky, pravítka a logaritmického pravítka. Do publikovatelné podoby se zpracovávaly ručním překreslováním pomocí milimetrového, semilogaritmického či logaritmického papíru případně v průsvitné formě. Pro zhotovování výkresů sloužila originální předtištěná šablona, které se říkalo „duševní majetek“ viz Obr. 3.

ČSHS: Obr. 3 - Výřez formuláře pro technické výkresy „duševní majetek“.

Bylo to náročné na oči. Kalkulačka, která uměla jen základní 4 matematické operace, byla velká jako dnešní desktop a byla jedna pro celou skupinu. Plánování experimentů se muselo dělat s ohledem na až roční lhůty pro přidělování deviz a objednacích procedur ze zahraničí. Pro celou skupinu byl 1 psací stroj a 1 telefonní přístroj přes ruční ústřednu. Protože tehdy ještě neexistovaly kopírky, tak se kopie článků, tzv. separáty, získávaly psaním žádanek autorům. Totéž činili i autoři odjinud Obr. 4. Každý autor si je schovával na konec roku, kdy fungovaly pro tzv. houpačku – soutěž o nejúspěšnějšího autora. I v takových podmínkách počet a kvalita vyprodukovaných publikací byla přinejmenším srovnatelná s tehdejším standardem ve světě.

ČSHS: Obr. 4a - Žádanky o kopie článků v časopisech.

ČSHS: Obr. 4b - Žádanky o kopie článků v časopisech.

ČSHS: Obr. 4c - Žádanky o kopie článků v časopisech.

Zpět k chlorovaným tetrahydrofuranům. Kromě termolability nešly detekovat UV detektorem. Tehdy se experimentovalo s transportním drátovým detektorem. Použila se modifikace s plamenovým detektorem s alkalickým kovem známým v plynové chromatografii jako selektivním detektorem na halogeny, viz Obrázek 2 a publikace (4). Nakonec se podařilo reakční produkty chlorace separovat v mikropreparativním měřítku a strukturu určit pomocí NMR spekter v Lachemě Brno, M. Holík. Kromě diplomové a rigorosní práce se výsledky objevily i v publikaci (5).

Od tohoto bodu nula začal vývoj v řadě směrů. Instrumentace se zlepšovala díky spolupráci s k. p. Laboratorní přístroje Praha (J. Čoupek) a Vývojovými dílnami ČSAV Praha. Zásadní změna instrumentace, zejména pokud jde o materiály kolon, přišla s potřebou používat vodné mobilní fáze a nepolární povrchy sorbentů což bylo nezbytné pro separace látek významných ve farmacii, biologii a medicíně a dál k nezbytnosti zavedení instrumentace a sorbentů odolných vůči vodným roztoků o širokém rozsahu pH. Objevil se termín chromatografie s obrácenými fázemi, z angličtiny zkratka RP HPLC. Studenti to dnes moc nechápou.

Vývoj se odehrával i v oblasti presentací výsledků. Na 3rd Symposium on Column Liquid Chromatography, Salzburg, září 1978 se přišlo s posterovými prezentacemi. Poster byl připraven typicky na jednom velkém srolovaném papíru, doba vyvěšení zlomek hodiny. Předpoklad ‐ přednáška pro hlouček přítomných s ukazováním na poster. Několik desítek posterů v jedné místnosti. Dodržení časového harmonogramu i srozumitelnost byly velmi problematické.

Na konferenci Progress in Chromatography, 2nd Danube symposium, Karlovy Vary, duben 1979 měl přednášku prof. J. F. K. Huber, Vídeň, o multidimenzionální kapalinové chromatografii. Promítání diapozitivů bylo ruční, asistentem. Diapozitivy se vysypaly během přednášky ze zásobníku. Při vracení diapozitivů po tmě, ve spěchu je pravděpodobnost správného vložení 1 : 8. A navíc i pořadí je čistě statistická záležitost. Vznikla tak podle slov přednášejícího „random presentation“.

Ekonomickým motorem HPLC ve světě byl zejména farmaceutický průmysl. Význam HPLC pro československou farmacii si včas uvědomil i J. Šubert (Laboratoř pro kontrolu léčiv KÚNZ, Brno), jehož přispěním, viz např. publikace (6), byla zavedena HPLC do Československého lékopisu, ČSL 4 (1987), jako součást kontrolních metod.

MINIATURIZACE

Koncem 70. let byly aktuální diskuze o vlivu tzv. „stěnových efektů“ v náplňové koloně jako potenciální zábraně zmenšování průměru kolon. Byl to argument pro tehdy standardní 4 mm vnitřní průměr analytických kolon. Ještě při mé stáži ve Vídni v r. 1980 prof. Huber stále nepřijímal argumenty pro zmenšování průměru HPLC kolon. Jak se ukázalo, zhoršení účinnosti při použití úzkých kolon bylo způsobeno mimokolonovými příspěvky k rozmývání zón, a tak se potvrdil význam miniaturizace instrumentace HPLC tou měrou, že vznikl nový pojem mikrokolonová kapalinová chromatografie. Toto téma bylo nadále nosné pro celou skupinu v Brně. Miniaturizace šla až k testování kapilárních kolon mikronových průměrů s kapalnou stacionární na vnitřním povrchu. Díky miniaturnímu elektrochemickému detektoru vlastní konstrukce (7), viz Obr. 5a byly dosažené účinnosti separace na prázdné kapiláře o vnitřním průměru 16 mikrometrů (Obr. 5b) blízké teoretickým.

ČSHS: Obr. 5a - Nákres miniaturní elektrochemické cely připojené na výstup kapilární kolony, ref. (7).

ČSHS: Obr. 5b - Chromatogram kapilární kapalinové chromatografie, ref. (7).

Kapilární kapalinová chromatografie v prázdných kapilárách je výzvou dosud. Samozřejmě, že tehdy byly kapilární kolony skleněné, stejně jako v plynové chromatografii. Vyráběl je na ústavu svou technologií K. Tesařík. (8). Vzpomínám si, jak na výše zmíněné konferenci v K. Varech (1979) jeden přednášející prezentoval problémy GC způsobené kovovými ionty povrchu skla. Při diskusi po přednášce se jeden z účastníků (patrně z tehdejšího SSSR) zeptal, proč tedy nepoužívají kapiláry z taveného křemene. Celý sál se tehdy na něj obrátil jako na úplného ignoranta, vždyť přeci každý věděl, že z křemene se kapiláry dělat nedají.

Výzkum mikrokolonové HPLC na UIACh v 80. letech vedl k řadě významných výsledků. Výzkum byl umožněn mj. i návrhem elektrochemického detektoru pro mikrokolonovou kapalinovou chromatografii (9), který se dočkal i průmyslové realizace v k. p. Laboratorní přístroje pod označením EMD10, viz Obr. 6, a publikace (10). Tento detektor byl vhodný zejména pro kazetové skleněné náplňové mikrokolony produkované firmou Tessek, Praha (J. Čoupek) Obrázek 6a,b. Detektor EMD 10 byl základem pro simultánní konduktometricko‐ampéromerický detektor (11) který byl zabudován i do mikrokolonového chromatografu zvaného Pikochromatograf.

ČSHS: Obr. 6a - Elektrochemický detektor pro mikrokolonovou kapalinovou chromatografii, průmyslová realizace v k. p. Laboratorní přístroje pod označením EMD10, ref. (9, 10).

ČSHS: Obr. 6b - Elektrochemický detektor pro mikrokolonovou kapalinovou chromatografii, průmyslová realizace v k. p. Laboratorní přístroje pod označením EMD10, ref. (9, 10).

Vývoj Pikochromatografu začal v r. 1985, Obr. 7a (12). Dávkovač kapalin integroval v jedné vysokotlaké skleněné stříkačce funkci vysokotlakého mikročerpadla s možností programovaného binárního gradientu mobilní fáze s funkcí mikrodávkovače vzorku. Funkční vzorek řízený počítačem PMD 85 vznikl v r. 1987, kde byl ještě využit detektor EMD 10, viz Obr. 7b.

ČSHS: Obr. 7a - Mikrokolonový kapalinový chromatograf – princip, ref. (12).

ČSHS: Obr. 7b - Mikrokolonový kapalinový chromatograf - funkční vzorek, ref. (12).

Prototyp průmyslově vyrobené verze byl vystaven na veletrhu Achema VI. 1988, viz Obr. 8 a na výstavě vědeckých přístrojů v září 1989 v Berlíně (13).

ČSHS: Obr. 8a - Průmyslová realizace mikrokolonového kapalinového chromatografu „Pikochromatograf“ pod označením pLC 01, ref. (13).

ČSHS: Obr. 8b - Průmyslová realizace mikrokolonového kapalinového chromatografu „Pikochromatograf“ pod označením pLC 01, ref. (13).

Na Obr. 9 jsou ukázky separací aminokyselin 9a a iontů 9b (11, 12, 13). Zájem o přístroj projevilo několik firem, přístroj zřejmě předběhl dobu. V Berlíně té doby však svět sledoval davy občanů NDR proudících přes Maďarsko do Rakouska a manažeři českého průmyslu začali mít jiné zájmy než vědecké přístroje.

ČSHS: Obr. 9 - Záznam separací na pLC‐01, a‐ záznam separace derivátů aminokyselin, b‐ záznam separace aniontů, ref. (13).

Přehled mikrokolonové chromatografie nejen na UIACh je v Krejčího monografii (14), která navazuje na Krejčího DrSc. disertaci v roce 1987. Foto z oslav obhajoby je na Obrázku 10.

ČSHS: Obr. 10 - Na obhajobě titulu DrSc. M. Krejčího, jaro 1987. Zleva J. Janák, J. Čoupek, M. Krejčí.

V r. 1980 bylo rozhodnuto o výstavbě nového ústavu, Obrázek 11, ale ke stěhování došlo až po r. 1990, i když výstavba budovy byla zahájena jako rychlostavba. Od té doby vývoj HPLC v Brně dále pokračoval, jeho stopa je dobře zachycená v moderních médiích, takže je pro případného zájemce dobře dostupná. Obrázek nového ústavu a mnoho dalších skutečností viz http://www.iach.cz.

ČSHS: Obr. 11 - Vize nové budovy UIACh.

ZÁVĚREM

Jak patrno, vývoj v posledních 40 letech nepřinesl jen převrat v komunikačních technologiích, ale i v kapalinové chromatografii.