LCMS
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití
LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena. Obsah dostupný pod licencí CC BY-SA 4.0 Uveďte původ-Zachovejte licenci.
Autor
Česká chromatografická škola
Našim cílem je propagace, šíření a podpora analytické chemie, především HPLC, GC a CE, jako základních separačních metod. Vzdělávání v oblasti separačních metod bychom chtěli pojmout jako kontinuální proces získávání a rozvoje vědomostí, intelektových schopností a praktických dovedností nad rámec obecného vzdělání.
Tagy
Článek
Akademie
Logo of LinkedIn

Tipy a triky v HPLC: Iontová párová chromatografie

Út, 29.3.2022
| Originální článek z: Česká chromatografická škola/Michal Douša
Iontová párová chromatografie je separační metoda zlepšující (nebo umožňující) separaci sloučenin iontové povahy.
Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Iontová párová chromatografie

Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Iontová párová chromatografie

Objevení metody iontové chromatografie se připisuje Dr. Gordonu Schillovi a spol. v roce 1973. (1, 2) Iontová párová chromatografie je separační metoda zlepšující (nebo umožňující) separaci sloučenin iontové povahy. Použitím iontového páru dochází většinou ke zlepšení tvaru píku (tailing faktor) a zvýšení rozlišení. Mechanismus separace pomocí iontového páru je popsán níže.

V minulosti se k chromatografické separaci používala metoda iontové suprese - pH mobilní fáze se upravuje na takovou hodnotu, aby analyt vystupoval v neionizované formě. Bohužel k dosažení této podmínky se musí pH mobilní fáze upravovat na poměrně extrémní hodnoty (pH<2 a pH>8) a navíc vzorek obsahuje jistě více než jednu ionizovatelnou sloučeninu.

K separaci iontových sloučenin je možné použít poměrně oblíbenou ionexovou chromatografii, která však není použitelná obecně ve všech případech.

Výhody iontové párové chromatografie oproti ionexové chromatografii jsou:
  • jednoduchá příprava mobilní fáze

  • široký výběr iontových párových činidel, jejichž koncentrací a typem činidla můžeme ovlivnit rozlišení a retenci

  • významné ovlivnění retence látek

  • současné separace iontových i neutrálních sloučenin

  • reprodukovatelnost výsledků

  • zvýšení účinnosti kolony

  • možnost použití gradientové eluce (delší doba ekvilibrace kolony !)

Jako iontová párová činidla se používají sodné soli alkylsulfonových kyselin (pentan-, hexan-, heptan-, oktan- a dodekansulfonáty) k separaci sloučenin kationtového typu a N-alkyl kvartérní amoniové soli (bromidy, sírany nebo chloridy) k separaci sloučenin aniontového typu.

Na čistotu iontových párových činidel jsou kladeny vysoké požadavky (HPLC grade), typické absorbance těchto sloučenin jsou uvedeny v tabulce. Jak je z tabulky patrné, jsou hodnoty absorbance ve většině případech nižší než běžně používané solventy methanol a acetonitril čistoty HPLC grade.

Tab 1. Typická absorbance (AUFS) vodných roztoků iontových párových činidel o koncentraci 5 mM
Alkyl-sulfonát - 200 nm / 210 nm
  • pentan - 0.006 / 0.002
  • hexan - 0.048 / 0.018
  • heptan - 0.008 / 0.001
  • oktan - 0.001 / 0.003
  • dodekan - 0.002 / 0.003
Alkyl-N(CH₃)₃ - 200 nm / 210 nm
  • pentan - 0.060 / 0.001
  • hexan - 0.059 / 0.006
  • heptan - 0.022 / 0.009
  • oktan - 0.082 / 0.003
  • dodekan - 0.102 / 0.013
Obecně retence iontové párové chromatografie závisí na:
  • koncentraci protiiontu (3) – s rostoucí koncentrací protiiontu retence separovaných látek s opačným nábojem roste, pro vyšší koncentrace protiiontu (asi nad 10 mmol/l) s rostoucí koncentrací protiiontu se retence separovaných látek s opačným nábojem vyrovnává a zvýšením koncentrace protiiontu se retence již nemění.

HPLC.cz: Vliv koncetrace protiontu na retenci

  • velikosti alkylu protiiontu i chromatografovaného iontu (s rostoucí velikostí retence roste). Při optimalizaci separace se vybírá takový protion, který zajišťuje přijatelné rozlišení vzhledem k době analýzy.

  • iontové sile a pH mobilní fáze - nastavení optimálního pH mobilní fáze podporuje disociaci chromatografovaných látek a tím i tvorbu iontových párů. Vliv pH mobilní fáze na retenčním poměru je ukázán na obrázku 2. pH mobilní fáze se nejčastěji upravuje na takovou hodnotu, aby bylo dosaženo maximálního rozlišení.

Závislost retence na délce alkylu
  • Chromatografické podmínky: (60/40) voda/methanol + 5 mM 1-alkyl-triethylamonniumfosfát, průtok: 0,6 ml/min
  • Vysvětlivky: £ - benzylalkohol, - kyselina benzoová

HPLC.cz: Obrázek 1. Závislost retence na délce alkylu

Závislost retenčního poměru benzoová kyselina/benzylalkohol na pH mobilní fáze
  • Chromatografické podmínky: (60/40) voda/methanol + 5 mM 1-alkyl-triethylamonniumfosfát, průtok: 0,6 ml/min
  • Vysvětlivky: £ - oktyl-,  - heptyl-, r - hexyl-

HPLC.cz: Obrázek 2. Závislost retenčního poměru benzoová kyselina/benzylalkohol na pH mobilní fáze

Jako další aditiva k přípravě mobilní fáze se používají: triethylamin, trihexylamin, triheptylamin a kyseliny octová, fosforečná a trifluorctová (TFA).

TFA je obecně nejpoužívanější aditivum při přípravě mobilní fáze v iontové párové chromatografii, protože jde o těkavé činidlo a dá se tudíž dobře odstranit (spojení LC/MS), je dobře rozpustný i při vyšších koncentrací organických solventů v mobilní fázi a má velmi nízkou absorbanci - nevýhodou je jeho CutOff okolo 230 nm.

Praktický příklad použítí iontových párů na sepatraci 4-aminophenolu je ukázán na obrázku níže.

Separace 4-aminophenolu (c = 0,5 mg/ml).
  • Chromatografické podmínky: Mravenčan amonný pH 3,8 – ACN (95+5). UV detekce 230 nm.

HPLC.cz: Separace 4-aminophenolu (c = 0,5 mg/ml)

Separace 4-aminophenolu (c = 0,5 mg/ml).
  • Chromatografické podmínky: 5 mM hexansulfonová kyselina/TEA/H3PO4 pH 2,5 – ACN (90+10). UV detekce 230 nm.

HPLC.cz: Separace 4-aminophenolu (c = 0,5 mg/ml)

Chromatografie iontových párů - principy

Při chromatografii iontových párů se využívá tvorby iontových asociátů mezi separovanými látkami iontové povahy a opačně nabitým iontem, jehož molekula obsahuje relativně velký nepolární podíl. Chromatografie iontových párů má navrženy dva modely separace - dynamický model iontové chromatografie a mechanismus separace iontových párů. Chromatografie iontových párů je velice silný nástroj k ovlivnění selektivity separovaných látek iontové povahy, přičemž retence látek neutrální povahy se téměř neovlivní. Retence separovaných látek s opačným nábojem než vlastní protiiont se zvyšuje, retence separovaných látek se stejným nábojem jako vlastní protiiont se snižuje.

Model iontových párů

V tomto modelu se předpokládá vznik iontových párů mezi chromatografovanými disociovanými kyselinami nebo zásadami s opačně nabitými ionty v mobilní fázi. Vzniklé iontové páry jsou neutrální (hydrofobní) a proto jsou na rozdíl od látek iontové povahy zadržovány na nepolární fázi a vykazují podstatně zvýšenou retenci.

Mechanismus vzniku iontových párů lze znázornit:

HPLC.cz: Mechanismus vzniku iontových párů

a tomuto ději odpovídá rovnovážná konstanta

HPLC.cz: Rovnovážná konstanta

a pro distribuční konstantu KD můžeme napsat

HPLC.cz: Distribuční konstanta

Z výše uvedené rovnice je zřejmé, že retence vzniklého iontového páru roste s rostoucí koncentrací protiiontu (A) v mobilní fázi.

Protolyticky lze pro tvorbu iontového asociátu psát:

HPLC.cz: Protolytická tvorba iontového asociátu

Obecně retence závisí na:

1. koncentraci protiiontu (3) – pro nízké koncentrace protiiontu (do 10 mmol/l) s rostoucí koncentrací protiiontu retence separovaných látek s opačným nábojem roste, pro vyšší koncentrace protiiontu (asi nad 10 mmol/l) s rostoucí koncentrací protiiontu se retence separovaných látek s opačným nábojem vyrovnává a zvýšením koncentrace protiiontu se retence již nemění. Při jaké koncentraci protiiontu dojde k vyrovnání retence závisí na složení mobilní fáze a na délce alkylového řetězce protiiontu.

Na obrázku je ukázka separace ve vodě rozpustných vitaminů a vliv na koncentrace hexansulfonové kyseliny na retenci jednotlivých vitaminů. Je vidět, že se rostoucí koncentrací protiiontu retence kationtů roste (niacinamid, pyridoxal, pyridoxamin, pyridoxin) a aniontu klesá (kyselina panthotenová).

Je zřejmé, že optimální koncentrace protiiontu je asi 10 mmol/l, kdy rozlišení všech separovaných složek je optimální. Při koncentraci protiiontu 5 mmol/l nedochází k separaci pyridoxalu a kyseliny panthotenové.

2. velikosti alkylu protiiontu i chromatografovaného iontu (s rostoucí velikostí retence roste)

3. iontové sile a pH mobilní fáze.

Nastavení optimálního pH mobilní fáze podporuje disociaci chromatografovaných látek a tím i tvorbu iontových párů. Tato technika tak otevírá řadu možností pro ovlivnění selektivity dělení chromatografovaných látek. Nevýhodou této techniky je potřeba poměrně dlouhé ustanovení rovnováhy na chromatografické koloně – tzn. potřeba dlouhé doby k ekvilibrace kolony (nejméně 30 kolonových objemů).

Jako iontových párů se používají pro báze silné organické kyseliny (alkansulfonové – pentyl- , hexyl-, heptyl- nebo oktylsulfonové) a pH mobilní fáze se upravuje na hodnotu pH 3-4.

Jako protiionty pro kyseliny slouží kvartérní amoniové soli a pH mobilní fáze se upravuje na hodnotu pH 7-8 (tetrabutylamoniumfosfát, cetyltrimethylamoniumsulfát). Pracovní koncentrace protiiontů se pohybuje okolo 5 až 10 mmol/l.

HPLC.cz: Obrázek č. 1 Vliv koncentrace protiiontu (sodná sůl hexansulfonové kyseliny) v mobilní fázi na kapacitní poměr ve vodě rozpustných vitaminů

Model dynamické iontové chromatografie

Tento model předpokládá tzv. dynamickou iontovou výměnu (interakci) mezi chromatografovanými látkami iontové povahy s opačně nabitými částicemi protiiontu, který je dynamicky vázán na povrch stacionární fáze, který je dodáván mobilní fází. Model je graficky zobrazen na obrázku.

HPLC.cz: Obrázek č. 2 Model dynamické iontové chromatografie

Izokratickou retenci v ion-párové chromatografii je možné pospat rovnicí (4):

HPLC.cz: Rovnice izokratické retence v ion-párové chromatografii

kde KHA je retenční faktor kyseliny(nebo báze), KA je retenční faktor ionizované formy (kyseliny nebo báze), k₄ je hypotetická retence iontového asociátu díky adsorpci na stacionárná fázi, K₂ je rovnovážná konstanta iontového asociátu v mobilní fázi, K₃ je rovnovážná konstanta iontového asociátu ve stacionární fázi, CIP je koncentrace ion-párového činidla, pH je pH mobilní fáze a pKₐje disociační konstanta solutu.

Zdroje

(1) Eksborg, S.; Lagerstrom, P.; Modin, R.; Schill, G.; Ion Pair Chromatography of Organic Compounds; J. Chrom. 1973, 83, 99.

(2) Eksborg, S.; Schill, G.; Ion Pair Partition Chromatography of Organic Ammonium Compounds; Anal. Chem. 1973, 45, 2092

(3) Knox J.H., Hartwick R.A.: J. Chromatogr. 204, 3 (1981)

(4) Jianwei Li: Anal. Chim. Acta 522 (2004) 113-126.

Česká chromatografická škola
 

Mohlo by Vás zajímat

Halogens and sulfur in solid samples according to EN 17813

Aplikace
| 2024 | Metrohm
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Metrohm
Zaměření
Životní prostředí

Determination of carbohydrates in peanuts by HPAE-PAD

Aplikace
| 2024 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Targeted PFAS Analysis in Industrial Wastewater Using the Agilent 6475 Triple Quadrupole LC/MS System

Aplikace
| 2024 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí

Multifaceted Evaluation of IgG Glycan Profiles Considering the Components in Glycosyltransferase Reactions

Aplikace
| 2024 | Shimadzu
Instrumentace
ICP/MS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Farmaceutická analýza

WATER NEEDS IN PHARMA QUALITY CONTROL

Brožury a specifikace
| 2019 | ELGA LabWater
Instrumentace
Laboratorní přístroje
Výrobce
ELGA LabWater
Zaměření
Farmaceutická analýza
 

Podobné články


Článek | Produkt

Thermo Scientific Stellar - revoluční hmotnostní spektrometr

Thermo Scientific Stellar MS - jedinečné propojení kvadrupólu, iontově koncentračního multipólu a dvojtlaké lineární iontové pasti přináší dosud nevídanou rychlost a přesnost analýz.
Pragolab
more

Článek | Produkt

Přístroje pro extrakci na pevné fázi (SPE)

Extrakce na pevné fázi (SPE) může být použita jak pro čištění, tak i pro zakoncentrování vzorků. Volba přístroje pro SPE významně ovlivňuje kvalitu a spolehlivost analytických výsledků.
Altium International
more

Článek | Zdraví

Patogenní mikroorganismy a Listeria monocytogenes

Patogenní (choroboplodné) mikroorganismy způsobují onemocnění lidí, zvířat nebo rostlin. Změny v Nařízení (ES) č. 2073/2005 platné od 1. 1. 2026.
ALS Czech Republic
more

Článek | Věda a výzkum

Vyvíjíme novou chemii pro pochopení biologie

Čerstvý držitel start-up grantu Athanasios Markos a jeho vývoj chemických nástrojů, které umožní studovat biomolekuly, ale také cíleně ovlivňovat biologické procesy přímo v živých systémech.
Nadace Experientia
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Halogens and sulfur in solid samples according to EN 17813

Aplikace
| 2024 | Metrohm
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Metrohm
Zaměření
Životní prostředí

Determination of carbohydrates in peanuts by HPAE-PAD

Aplikace
| 2024 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Targeted PFAS Analysis in Industrial Wastewater Using the Agilent 6475 Triple Quadrupole LC/MS System

Aplikace
| 2024 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí

Multifaceted Evaluation of IgG Glycan Profiles Considering the Components in Glycosyltransferase Reactions

Aplikace
| 2024 | Shimadzu
Instrumentace
ICP/MS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Farmaceutická analýza

WATER NEEDS IN PHARMA QUALITY CONTROL

Brožury a specifikace
| 2019 | ELGA LabWater
Instrumentace
Laboratorní přístroje
Výrobce
ELGA LabWater
Zaměření
Farmaceutická analýza
 

Podobné články


Článek | Produkt

Thermo Scientific Stellar - revoluční hmotnostní spektrometr

Thermo Scientific Stellar MS - jedinečné propojení kvadrupólu, iontově koncentračního multipólu a dvojtlaké lineární iontové pasti přináší dosud nevídanou rychlost a přesnost analýz.
Pragolab
more

Článek | Produkt

Přístroje pro extrakci na pevné fázi (SPE)

Extrakce na pevné fázi (SPE) může být použita jak pro čištění, tak i pro zakoncentrování vzorků. Volba přístroje pro SPE významně ovlivňuje kvalitu a spolehlivost analytických výsledků.
Altium International
more

Článek | Zdraví

Patogenní mikroorganismy a Listeria monocytogenes

Patogenní (choroboplodné) mikroorganismy způsobují onemocnění lidí, zvířat nebo rostlin. Změny v Nařízení (ES) č. 2073/2005 platné od 1. 1. 2026.
ALS Czech Republic
more

Článek | Věda a výzkum

Vyvíjíme novou chemii pro pochopení biologie

Čerstvý držitel start-up grantu Athanasios Markos a jeho vývoj chemických nástrojů, které umožní studovat biomolekuly, ale také cíleně ovlivňovat biologické procesy přímo v živých systémech.
Nadace Experientia
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Halogens and sulfur in solid samples according to EN 17813

Aplikace
| 2024 | Metrohm
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Metrohm
Zaměření
Životní prostředí

Determination of carbohydrates in peanuts by HPAE-PAD

Aplikace
| 2024 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Targeted PFAS Analysis in Industrial Wastewater Using the Agilent 6475 Triple Quadrupole LC/MS System

Aplikace
| 2024 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí

Multifaceted Evaluation of IgG Glycan Profiles Considering the Components in Glycosyltransferase Reactions

Aplikace
| 2024 | Shimadzu
Instrumentace
ICP/MS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Farmaceutická analýza

WATER NEEDS IN PHARMA QUALITY CONTROL

Brožury a specifikace
| 2019 | ELGA LabWater
Instrumentace
Laboratorní přístroje
Výrobce
ELGA LabWater
Zaměření
Farmaceutická analýza
 

Podobné články


Článek | Produkt

Thermo Scientific Stellar - revoluční hmotnostní spektrometr

Thermo Scientific Stellar MS - jedinečné propojení kvadrupólu, iontově koncentračního multipólu a dvojtlaké lineární iontové pasti přináší dosud nevídanou rychlost a přesnost analýz.
Pragolab
more

Článek | Produkt

Přístroje pro extrakci na pevné fázi (SPE)

Extrakce na pevné fázi (SPE) může být použita jak pro čištění, tak i pro zakoncentrování vzorků. Volba přístroje pro SPE významně ovlivňuje kvalitu a spolehlivost analytických výsledků.
Altium International
more

Článek | Zdraví

Patogenní mikroorganismy a Listeria monocytogenes

Patogenní (choroboplodné) mikroorganismy způsobují onemocnění lidí, zvířat nebo rostlin. Změny v Nařízení (ES) č. 2073/2005 platné od 1. 1. 2026.
ALS Czech Republic
more

Článek | Věda a výzkum

Vyvíjíme novou chemii pro pochopení biologie

Čerstvý držitel start-up grantu Athanasios Markos a jeho vývoj chemických nástrojů, které umožní studovat biomolekuly, ale také cíleně ovlivňovat biologické procesy přímo v živých systémech.
Nadace Experientia
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Halogens and sulfur in solid samples according to EN 17813

Aplikace
| 2024 | Metrohm
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Metrohm
Zaměření
Životní prostředí

Determination of carbohydrates in peanuts by HPAE-PAD

Aplikace
| 2024 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
Iontová chromatografie
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Targeted PFAS Analysis in Industrial Wastewater Using the Agilent 6475 Triple Quadrupole LC/MS System

Aplikace
| 2024 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí

Multifaceted Evaluation of IgG Glycan Profiles Considering the Components in Glycosyltransferase Reactions

Aplikace
| 2024 | Shimadzu
Instrumentace
ICP/MS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Farmaceutická analýza

WATER NEEDS IN PHARMA QUALITY CONTROL

Brožury a specifikace
| 2019 | ELGA LabWater
Instrumentace
Laboratorní přístroje
Výrobce
ELGA LabWater
Zaměření
Farmaceutická analýza
 

Podobné články


Článek | Produkt

Thermo Scientific Stellar - revoluční hmotnostní spektrometr

Thermo Scientific Stellar MS - jedinečné propojení kvadrupólu, iontově koncentračního multipólu a dvojtlaké lineární iontové pasti přináší dosud nevídanou rychlost a přesnost analýz.
Pragolab
more

Článek | Produkt

Přístroje pro extrakci na pevné fázi (SPE)

Extrakce na pevné fázi (SPE) může být použita jak pro čištění, tak i pro zakoncentrování vzorků. Volba přístroje pro SPE významně ovlivňuje kvalitu a spolehlivost analytických výsledků.
Altium International
more

Článek | Zdraví

Patogenní mikroorganismy a Listeria monocytogenes

Patogenní (choroboplodné) mikroorganismy způsobují onemocnění lidí, zvířat nebo rostlin. Změny v Nařízení (ES) č. 2073/2005 platné od 1. 1. 2026.
ALS Czech Republic
more

Článek | Věda a výzkum

Vyvíjíme novou chemii pro pochopení biologie

Čerstvý držitel start-up grantu Athanasios Markos a jeho vývoj chemických nástrojů, které umožní studovat biomolekuly, ale také cíleně ovlivňovat biologické procesy přímo v živých systémech.
Nadace Experientia
more
Další projekty
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití
LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena. Obsah dostupný pod licencí CC BY-SA 4.0 Uveďte původ-Zachovejte licenci.