Tipy a triky v HPLC: Iontová párová chromatografie | LabRulez LCMS

Tipy a triky v HPLC: Iontová párová chromatografie

Po, 28.3.2022
| Originální článek z: Česká chromatografická škola/Michal Douša
Iontová párová chromatografie je separační metoda zlepšující (nebo umožňující) separaci sloučenin iontové povahy.
Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Iontová párová chromatografie

Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Iontová párová chromatografie

Objevení metody iontové chromatografie se připisuje Dr. Gordonu Schillovi a spol. v roce 1973. (1, 2) Iontová párová chromatografie je separační metoda zlepšující (nebo umožňující) separaci sloučenin iontové povahy. Použitím iontového páru dochází většinou ke zlepšení tvaru píku (tailing faktor) a zvýšení rozlišení. Mechanismus separace pomocí iontového páru je popsán níže.

V minulosti se k chromatografické separaci používala metoda iontové suprese - pH mobilní fáze se upravuje na takovou hodnotu, aby analyt vystupoval v neionizované formě. Bohužel k dosažení této podmínky se musí pH mobilní fáze upravovat na poměrně extrémní hodnoty (pH<2 a pH>8) a navíc vzorek obsahuje jistě více než jednu ionizovatelnou sloučeninu.

K separaci iontových sloučenin je možné použít poměrně oblíbenou ionexovou chromatografii, která však není použitelná obecně ve všech případech.

Výhody iontové párové chromatografie oproti ionexové chromatografii jsou:
  • jednoduchá příprava mobilní fáze

  • široký výběr iontových párových činidel, jejichž koncentrací a typem činidla můžeme ovlivnit rozlišení a retenci

  • významné ovlivnění retence látek

  • současné separace iontových i neutrálních sloučenin

  • reprodukovatelnost výsledků

  • zvýšení účinnosti kolony

  • možnost použití gradientové eluce (delší doba ekvilibrace kolony !)

Jako iontová párová činidla se používají sodné soli alkylsulfonových kyselin (pentan-, hexan-, heptan-, oktan- a dodekansulfonáty) k separaci sloučenin kationtového typu a N-alkyl kvartérní amoniové soli (bromidy, sírany nebo chloridy) k separaci sloučenin aniontového typu.

Na čistotu iontových párových činidel jsou kladeny vysoké požadavky (HPLC grade), typické absorbance těchto sloučenin jsou uvedeny v tabulce. Jak je z tabulky patrné, jsou hodnoty absorbance ve většině případech nižší než běžně používané solventy methanol a acetonitril čistoty HPLC grade.

Tab 1. Typická absorbance (AUFS) vodných roztoků iontových párových činidel o koncentraci 5 mM
Alkyl-sulfonát - 200 nm / 210 nm
  • pentan - 0.006 / 0.002
  • hexan - 0.048 / 0.018
  • heptan - 0.008 / 0.001
  • oktan - 0.001 / 0.003
  • dodekan - 0.002 / 0.003
Alkyl-N(CH₃)₃ - 200 nm / 210 nm
  • pentan - 0.060 / 0.001
  • hexan - 0.059 / 0.006
  • heptan - 0.022 / 0.009
  • oktan - 0.082 / 0.003
  • dodekan - 0.102 / 0.013
Obecně retence iontové párové chromatografie závisí na:
  • koncentraci protiiontu (3) – s rostoucí koncentrací protiiontu retence separovaných látek s opačným nábojem roste, pro vyšší koncentrace protiiontu (asi nad 10 mmol/l) s rostoucí koncentrací protiiontu se retence separovaných látek s opačným nábojem vyrovnává a zvýšením koncentrace protiiontu se retence již nemění.

HPLC.cz: Vliv koncetrace protiontu na retenci

  • velikosti alkylu protiiontu i chromatografovaného iontu (s rostoucí velikostí retence roste). Při optimalizaci separace se vybírá takový protion, který zajišťuje přijatelné rozlišení vzhledem k době analýzy.

  • iontové sile a pH mobilní fáze - nastavení optimálního pH mobilní fáze podporuje disociaci chromatografovaných látek a tím i tvorbu iontových párů. Vliv pH mobilní fáze na retenčním poměru je ukázán na obrázku 2. pH mobilní fáze se nejčastěji upravuje na takovou hodnotu, aby bylo dosaženo maximálního rozlišení.

Závislost retence na délce alkylu
  • Chromatografické podmínky: (60/40) voda/methanol + 5 mM 1-alkyl-triethylamonniumfosfát, průtok: 0,6 ml/min
  • Vysvětlivky: £ - benzylalkohol, - kyselina benzoová

HPLC.cz: Obrázek 1. Závislost retence na délce alkylu

Závislost retenčního poměru benzoová kyselina/benzylalkohol na pH mobilní fáze
  • Chromatografické podmínky: (60/40) voda/methanol + 5 mM 1-alkyl-triethylamonniumfosfát, průtok: 0,6 ml/min
  • Vysvětlivky: £ - oktyl-,  - heptyl-, r - hexyl-

HPLC.cz: Obrázek 2. Závislost retenčního poměru benzoová kyselina/benzylalkohol na pH mobilní fáze

Jako další aditiva k přípravě mobilní fáze se používají: triethylamin, trihexylamin, triheptylamin a kyseliny octová, fosforečná a trifluorctová (TFA).

TFA je obecně nejpoužívanější aditivum při přípravě mobilní fáze v iontové párové chromatografii, protože jde o těkavé činidlo a dá se tudíž dobře odstranit (spojení LC/MS), je dobře rozpustný i při vyšších koncentrací organických solventů v mobilní fázi a má velmi nízkou absorbanci - nevýhodou je jeho CutOff okolo 230 nm.

Praktický příklad použítí iontových párů na sepatraci 4-aminophenolu je ukázán na obrázku níže.

Separace 4-aminophenolu (c = 0,5 mg/ml).
  • Chromatografické podmínky: Mravenčan amonný pH 3,8 – ACN (95+5). UV detekce 230 nm.

HPLC.cz: Separace 4-aminophenolu (c = 0,5 mg/ml)

Separace 4-aminophenolu (c = 0,5 mg/ml).
  • Chromatografické podmínky: 5 mM hexansulfonová kyselina/TEA/H3PO4 pH 2,5 – ACN (90+10). UV detekce 230 nm.

HPLC.cz: Separace 4-aminophenolu (c = 0,5 mg/ml)

Chromatografie iontových párů - principy

Při chromatografii iontových párů se využívá tvorby iontových asociátů mezi separovanými látkami iontové povahy a opačně nabitým iontem, jehož molekula obsahuje relativně velký nepolární podíl. Chromatografie iontových párů má navrženy dva modely separace - dynamický model iontové chromatografie a mechanismus separace iontových párů. Chromatografie iontových párů je velice silný nástroj k ovlivnění selektivity separovaných látek iontové povahy, přičemž retence látek neutrální povahy se téměř neovlivní. Retence separovaných látek s opačným nábojem než vlastní protiiont se zvyšuje, retence separovaných látek se stejným nábojem jako vlastní protiiont se snižuje.

Model iontových párů

V tomto modelu se předpokládá vznik iontových párů mezi chromatografovanými disociovanými kyselinami nebo zásadami s opačně nabitými ionty v mobilní fázi. Vzniklé iontové páry jsou neutrální (hydrofobní) a proto jsou na rozdíl od látek iontové povahy zadržovány na nepolární fázi a vykazují podstatně zvýšenou retenci.

Mechanismus vzniku iontových párů lze znázornit:

HPLC.cz: Mechanismus vzniku iontových párů

a tomuto ději odpovídá rovnovážná konstanta

HPLC.cz: Rovnovážná konstanta

a pro distribuční konstantu KD můžeme napsat

HPLC.cz: Distribuční konstanta

Z výše uvedené rovnice je zřejmé, že retence vzniklého iontového páru roste s rostoucí koncentrací protiiontu (A) v mobilní fázi.

Protolyticky lze pro tvorbu iontového asociátu psát:

HPLC.cz: Protolytická tvorba iontového asociátu

Obecně retence závisí na:

1. koncentraci protiiontu (3) – pro nízké koncentrace protiiontu (do 10 mmol/l) s rostoucí koncentrací protiiontu retence separovaných látek s opačným nábojem roste, pro vyšší koncentrace protiiontu (asi nad 10 mmol/l) s rostoucí koncentrací protiiontu se retence separovaných látek s opačným nábojem vyrovnává a zvýšením koncentrace protiiontu se retence již nemění. Při jaké koncentraci protiiontu dojde k vyrovnání retence závisí na složení mobilní fáze a na délce alkylového řetězce protiiontu.

Na obrázku je ukázka separace ve vodě rozpustných vitaminů a vliv na koncentrace hexansulfonové kyseliny na retenci jednotlivých vitaminů. Je vidět, že se rostoucí koncentrací protiiontu retence kationtů roste (niacinamid, pyridoxal, pyridoxamin, pyridoxin) a aniontu klesá (kyselina panthotenová).

Je zřejmé, že optimální koncentrace protiiontu je asi 10 mmol/l, kdy rozlišení všech separovaných složek je optimální. Při koncentraci protiiontu 5 mmol/l nedochází k separaci pyridoxalu a kyseliny panthotenové.

2. velikosti alkylu protiiontu i chromatografovaného iontu (s rostoucí velikostí retence roste)

3. iontové sile a pH mobilní fáze.

Nastavení optimálního pH mobilní fáze podporuje disociaci chromatografovaných látek a tím i tvorbu iontových párů. Tato technika tak otevírá řadu možností pro ovlivnění selektivity dělení chromatografovaných látek. Nevýhodou této techniky je potřeba poměrně dlouhé ustanovení rovnováhy na chromatografické koloně – tzn. potřeba dlouhé doby k ekvilibrace kolony (nejméně 30 kolonových objemů).

Jako iontových párů se používají pro báze silné organické kyseliny (alkansulfonové – pentyl- , hexyl-, heptyl- nebo oktylsulfonové) a pH mobilní fáze se upravuje na hodnotu pH 3-4.

Jako protiionty pro kyseliny slouží kvartérní amoniové soli a pH mobilní fáze se upravuje na hodnotu pH 7-8 (tetrabutylamoniumfosfát, cetyltrimethylamoniumsulfát). Pracovní koncentrace protiiontů se pohybuje okolo 5 až 10 mmol/l.

HPLC.cz: Obrázek č. 1 Vliv koncentrace protiiontu (sodná sůl hexansulfonové kyseliny) v mobilní fázi na kapacitní poměr ve vodě rozpustných vitaminů

Model dynamické iontové chromatografie

Tento model předpokládá tzv. dynamickou iontovou výměnu (interakci) mezi chromatografovanými látkami iontové povahy s opačně nabitými částicemi protiiontu, který je dynamicky vázán na povrch stacionární fáze, který je dodáván mobilní fází. Model je graficky zobrazen na obrázku.

HPLC.cz: Obrázek č. 2 Model dynamické iontové chromatografie

**Izokratickou retenci v ion-párové chromatografii je možné pospat rovnicí (4):

HPLC.cz: Rovnice izokratické retence v ion-párové chromatografii

kde KHA je retenční faktor kyseliny(nebo báze), KA je retenční faktor ionizované formy (kyseliny nebo báze), k₄ je hypotetická retence iontového asociátu díky adsorpci na stacionárná fázi, K₂ je rovnovážná konstanta iontového asociátu v mobilní fázi, K₃ je rovnovážná konstanta iontového asociátu ve stacionární fázi, CIP je koncentrace ion-párového činidla, pH je pH mobilní fáze a pKₐje disociační konstanta solutu.

Zdroje

(1) Eksborg, S.; Lagerstrom, P.; Modin, R.; Schill, G.; Ion Pair Chromatography of Organic Compounds; J. Chrom. 1973, 83, 99.

(2) Eksborg, S.; Schill, G.; Ion Pair Partition Chromatography of Organic Ammonium Compounds; Anal. Chem. 1973, 45, 2092

(3) Knox J.H., Hartwick R.A.: J. Chromatogr. 204, 3 (1981)

(4) Jianwei Li: Anal. Chim. Acta 522 (2004) 113-126.

Česká chromatografická škola
 

Mohlo by Vás zajímat

Simultaneous analysis of drug substances according to USP assay and impurity methods

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Farmaceutická analýza

Matrix Matching or Isotope Dilution? A Comparison of Two Quantitation Approaches to Determine PFAS in Dairy Milk

Aplikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Food Metabolomics of Alcoholic Beverage Using Single-Quadrupole Mass Spectrometer — Oligosaccharide and Polysaccharide Profiling —

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Demonstrating the Applicability of the ACQUITY™ Premier Binary System for Long Shallow Gradient Peptide Mapping Analysis

Aplikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Waters
Zaměření
Proteomika

Qualitative Analysis of the Components in Foods Using DART and the Quadrupole Time- of-flight Mass Spectrometer

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, DART
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství
 

Podobné články

Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Průtoky mobilní fáze, kapacity analytické kolony a pufrované mobilní fáze

Jaké jsou typické hodnoty průtoku mobilní fáze a kapacity analytických kolon? Jak připravit mobilní fázi s použitím aditiv, které slouží k úpravě pH nebo iontové síly mobilní fáze?
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Separace na reverzních fázích

Separace na reverzních fázích je základem kapalinové chromatografie. Jak ji používat v extrémních oblastech pH, jak zvýšit retenci polárních látek a jaký vliv mají aktivity zbytkových silanolových skupin?
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Polární látky a solventy, Mez detekce a Stanovitelnosti, Asymetrie píků

Dnes se podíváme na několik různorodých témat jako LOD a LOQ, disociace polárních látek a jak ji potlačit, polární solventy a jejich empirická přenosová pravidla nebo asymetrie píku.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Chromatografická kolona a kapiláry, Životnost, Testování a deník chromatografické kolony

Jaké znáte typy HPLC kolon? Jak je správně uchovávat, instalovat a jak provést těsné spojení? Na čem závisí životnost kolony? Jak novou kolonu otestovat a vést její deník nebo použít kolonu s čipem?
 

Mohlo by Vás zajímat

Simultaneous analysis of drug substances according to USP assay and impurity methods

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Farmaceutická analýza

Matrix Matching or Isotope Dilution? A Comparison of Two Quantitation Approaches to Determine PFAS in Dairy Milk

Aplikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Food Metabolomics of Alcoholic Beverage Using Single-Quadrupole Mass Spectrometer — Oligosaccharide and Polysaccharide Profiling —

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Demonstrating the Applicability of the ACQUITY™ Premier Binary System for Long Shallow Gradient Peptide Mapping Analysis

Aplikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Waters
Zaměření
Proteomika

Qualitative Analysis of the Components in Foods Using DART and the Quadrupole Time- of-flight Mass Spectrometer

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, DART
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství
 

Podobné články

Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Průtoky mobilní fáze, kapacity analytické kolony a pufrované mobilní fáze

Jaké jsou typické hodnoty průtoku mobilní fáze a kapacity analytických kolon? Jak připravit mobilní fázi s použitím aditiv, které slouží k úpravě pH nebo iontové síly mobilní fáze?
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Separace na reverzních fázích

Separace na reverzních fázích je základem kapalinové chromatografie. Jak ji používat v extrémních oblastech pH, jak zvýšit retenci polárních látek a jaký vliv mají aktivity zbytkových silanolových skupin?
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Polární látky a solventy, Mez detekce a Stanovitelnosti, Asymetrie píků

Dnes se podíváme na několik různorodých témat jako LOD a LOQ, disociace polárních látek a jak ji potlačit, polární solventy a jejich empirická přenosová pravidla nebo asymetrie píku.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Chromatografická kolona a kapiláry, Životnost, Testování a deník chromatografické kolony

Jaké znáte typy HPLC kolon? Jak je správně uchovávat, instalovat a jak provést těsné spojení? Na čem závisí životnost kolony? Jak novou kolonu otestovat a vést její deník nebo použít kolonu s čipem?
 

Mohlo by Vás zajímat

Simultaneous analysis of drug substances according to USP assay and impurity methods

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Farmaceutická analýza

Matrix Matching or Isotope Dilution? A Comparison of Two Quantitation Approaches to Determine PFAS in Dairy Milk

Aplikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Food Metabolomics of Alcoholic Beverage Using Single-Quadrupole Mass Spectrometer — Oligosaccharide and Polysaccharide Profiling —

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Demonstrating the Applicability of the ACQUITY™ Premier Binary System for Long Shallow Gradient Peptide Mapping Analysis

Aplikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Waters
Zaměření
Proteomika

Qualitative Analysis of the Components in Foods Using DART and the Quadrupole Time- of-flight Mass Spectrometer

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, DART
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství
 

Podobné články

Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Průtoky mobilní fáze, kapacity analytické kolony a pufrované mobilní fáze

Jaké jsou typické hodnoty průtoku mobilní fáze a kapacity analytických kolon? Jak připravit mobilní fázi s použitím aditiv, které slouží k úpravě pH nebo iontové síly mobilní fáze?
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Separace na reverzních fázích

Separace na reverzních fázích je základem kapalinové chromatografie. Jak ji používat v extrémních oblastech pH, jak zvýšit retenci polárních látek a jaký vliv mají aktivity zbytkových silanolových skupin?
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Polární látky a solventy, Mez detekce a Stanovitelnosti, Asymetrie píků

Dnes se podíváme na několik různorodých témat jako LOD a LOQ, disociace polárních látek a jak ji potlačit, polární solventy a jejich empirická přenosová pravidla nebo asymetrie píku.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Chromatografická kolona a kapiláry, Životnost, Testování a deník chromatografické kolony

Jaké znáte typy HPLC kolon? Jak je správně uchovávat, instalovat a jak provést těsné spojení? Na čem závisí životnost kolony? Jak novou kolonu otestovat a vést její deník nebo použít kolonu s čipem?
 

Mohlo by Vás zajímat

Simultaneous analysis of drug substances according to USP assay and impurity methods

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Farmaceutická analýza

Matrix Matching or Isotope Dilution? A Comparison of Two Quantitation Approaches to Determine PFAS in Dairy Milk

Aplikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Food Metabolomics of Alcoholic Beverage Using Single-Quadrupole Mass Spectrometer — Oligosaccharide and Polysaccharide Profiling —

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Demonstrating the Applicability of the ACQUITY™ Premier Binary System for Long Shallow Gradient Peptide Mapping Analysis

Aplikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Waters
Zaměření
Proteomika

Qualitative Analysis of the Components in Foods Using DART and the Quadrupole Time- of-flight Mass Spectrometer

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, DART
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství
 

Podobné články

Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Průtoky mobilní fáze, kapacity analytické kolony a pufrované mobilní fáze

Jaké jsou typické hodnoty průtoku mobilní fáze a kapacity analytických kolon? Jak připravit mobilní fázi s použitím aditiv, které slouží k úpravě pH nebo iontové síly mobilní fáze?
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Separace na reverzních fázích

Separace na reverzních fázích je základem kapalinové chromatografie. Jak ji používat v extrémních oblastech pH, jak zvýšit retenci polárních látek a jaký vliv mají aktivity zbytkových silanolových skupin?
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Polární látky a solventy, Mez detekce a Stanovitelnosti, Asymetrie píků

Dnes se podíváme na několik různorodých témat jako LOD a LOQ, disociace polárních látek a jak ji potlačit, polární solventy a jejich empirická přenosová pravidla nebo asymetrie píku.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Chromatografická kolona a kapiláry, Životnost, Testování a deník chromatografické kolony

Jaké znáte typy HPLC kolon? Jak je správně uchovávat, instalovat a jak provést těsné spojení? Na čem závisí životnost kolony? Jak novou kolonu otestovat a vést její deník nebo použít kolonu s čipem?
Další projekty
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití

LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena.