Tipy a triky v HPLC: Polární látky a solventy, Mez detekce a Stanovitelnosti, Asymetrie píků

Mez detekce a mez stanovitelnosti

Citlivost jako směrnice kalibrační křivky, linearita, mez detekce (LOD – limit of detection) a mez stanovitelnosti (LOQ – limit of quantification) spolu úzce souvisí.

Mez detekce odpovídá koncentraci, pro kterou je analytický signál statisticky významně odlišný od šumu.

Mez stanovitelnosti odpovídá koncentraci, při které je přesnost stanovení taková, že dovoluje kvantitativní vyhodnocení.

Podle uzance se v separačních metodách mez detekce vyjadřuje jako trojnásobek šumu základní linie a mez stanovitelnosti jako desetinásobek šumu základní linie.

Mez citlivostí a oběma limity pak můžeme dovodit vztah:

HPLC.cz: Výpočet LOQ a LOQ

kde hn je šum na základní linii a m je směrnice kalibrační křivky (zde ale f (c)=h závislosti výšky píku na koncentraci). Předpokladem správného výpočtu je, aby šum a výška píku byly ve stejných jednotkách. Definice meze detekce je pak patrná z obrázku níže.

Rozborem rovnic se dojde k závěru, že na zvýšení citlivosti má vliv použitý chromatografický systém (šum - detektor, chromatografická čerpadla) a chromatografický proces (výška píku - chromatografická kolona a chromatograqfické podmínky). Pokud chceme snížit LOQ a LOD musíme zvýšit poměr signálu výška píku/šum. Jinak řečeno, čím vyšší bude výška píku a čím nižší bude šum, tím dostaneme nižší hodnoty LOQ a LOD. Rozmytí eluční zóny lze ovlivnit řadou parametrů - pro koncentraci solutu v maximu chromatografického píku cmax lze dovodit rovnici:

HPLC.cz: Výpočet koncentrace solutu v maximu chromatografického píku

Koncentrace solutu cmax v maximu eluční zóny se zvyšuje:

1. s objemem nástřiku vzorku Vi
2. zkracující se délkou kolony (L)
3. snížením vnitřního průměru dc kolony
4. zvyšující se eluční silou mobilní fáze (k)
5. zmenšením velikosti částeček náplně dp

HPLC.cz: Praktické znázornění definice a výpočet meze detekce

Z výpočtu pro LOD a LOQ je zřejmé, že čím vyšší bude odstup signálu od šumu, tím se dostaneme na nižší hodnoty LOQ a LOD. Proto pro zajímavost uvádím závislost pro výšku píku hp:

HPLC.cz: Rovnice pro závislost výšky píku

kde c0 je koncentrace analytu a AS je faktor symetrie.

Z rovnice vyplývá, že výška píku se bude zvyšovat se zvyšující se účinností kolony, objemem nástřiku a koncentrací a snižujícím se kapacitním poměrem analytu a objemovým průtokem mobilní fáze.

Další přístupy k výpočtu LOQ a LOD

Kromě již výše uvedených přístupů se ještě můžeme setkat s obdobným výpočtem, kde namísto šumu základní linie hn se počítá se směrodatnou odchylkou koeficientu sa lineární závislosti y = a + bx.

Vztahy pak vypadají takto:

HPLC.cz: Alternativní přístupy k výpočtu LOQ a LOD

Z mých vlastních zkušeností je ale hodnota směrodatnou odchylkou koeficientu sa lineární závislosti nižší než šum základní linie hn a dostáváme zcela jiné hodnoty.

Další z možných přístupů je výpočet LOQ a LOD z kalibrační přímky - linearity.

Velmi důležité je si uvědomit, že vypočtená hodnota LOQ by měla být součástí hodnocení linearity metody a hodnota LOQ musí být součástí kalibrační přímky, jinak tato hodnota zcel postrádá smysl.

Potlačení disociace polárních látek

Silně polární a iontové látky se na nepolárních fázích zadržují velmi málo nebo vůbec ne a eluují v mrtvém objemu kolony nebo dříve, než odpovídá mrtvému objemu kolony - což je jev tzv. iontové výluky.

Pro látky iontové povahy proto můžeme jejich chromatografické chování ovlivnit volbou pH mobilní fáze, kdy změnou pH mobilní fáze dochází k potlačení disociace slabých kyselin (pH < 7) či **slabých báz**í (pH > 7).

Potlačením disociace (obrázek níže) dochází ke zvýšení retence a zamezení chvostování píku dané chromatografované látky.

Pro organické kyseliny dochází k potlačení disociace snížením pH na hodnotu asi pH 2-5, pro organické báze dochází k potlačení disociace zvýšením pH na hodnotu asi pH 7-8, ale toto pH je omezeno rozpouštěním silikagelu při pH > 8,5.

Selektivita pro karboxylové kyseliny na reverzní fázi je závislá na použité mobilní fázi (její pH) a na použité reverzní fázi. V reverzních stacionárních fázích závisí retence jednosytné kyseliny HA na pH a na disociační konstantě karboxylové kyseliny Kₐ:

HPLC.cz: Výpočet retence jednosytné kyseliny

kde

HPLC.cz: Výpočet stupně disociace kyselin

k₀ a k₋₁ jsou retenční faktory neionizované a ionizované formy a a je stupeň disociace (frakce ionizovaných molekul).

Obdobně pro selektivitu bazí n reverzní fázi platí stejná rovnice kde

HPLC.cz: Výpočet stupně disociace bází

Zvýšení retence a zlepšení symetrie píků ionizovaných látek se může dosáhnout přídavkem neutrálních solí do mobilní fáze - tzv. vysolovací efekt. (1)

Závislost stupně disociace na pH (kyselina octová pKₐ = 4,76)

HPLC.cz: Závislost stupně disociace na pH

Jednoduchý kalkulátor pro výpočet % ionizace kyselin a bazí...

Empirická přenosová pravidla pro polární solventy

V praxi jsme omezeni při chromatografii na nepolárních fázích výběrem několika málo organických solventů - methanol, acetonitril, tetrahydrofuran popř. dioxan, přesto tyto poskytují dostatečnou změnu a ovlivnění selektivity, zejména v kombinaci s použitím solventů s pufry nebo solemi o různém pH.

O retenci rozhoduje především polarita solutu a polarita a koncentrace organického rozpouštědla v mobilní fázi. Pro výběr organických rozpouštědel a následné nahrazení jednoho rozpouštědla druhým bez výrazné změny retence, byly formulovány empirická přenosová pravidla, která zjednodušují možnost výběru jednotlivých organických rozpouštědel.

První empirické pravidlo bylo navrženo Schoenmakersem:

HPLC.cz: První empirické pravidlo (Schoenmakers)

Druhé empirické pravidlo bylo navrženo Haddadem:

HPLC.cz: Druhé empirické pravidlo (Haddad)

přičemž druhé pravidlo více odpovídá skutečnosti pro polární látky podléhající ionizaci.

Z rovnice (1) a (2) resp. (3) a (4) můžeme vypočítat např. koncentraci acetonitrilu (jMeCN) a tetrahydrofuranu (jTHF) jako účinné eluční složky při záměně za methanol o koncentraci (jMeOH) = 0,8. Pro acetonitril pak vyjde (jMeCN) = 0,66 a tetrahydrofuran (jTHF) = 0,53 podle rovnic (1) a (2) a (jMeCN) = 0,54 a tetrahydrofuran (jTHF) = 0,38 podle rovnic (3) a (4).

Asymetrie píku

Asymetrie píku je obecně praktická veličina kvality chromatografické kolony. Asymetrie píku je nežádoucí, souvisí s účinností kolony a má negativní vliv na integraci píku, zvláště, když je nízký poměr signál-šum.

Existují dvě metody vyjádření asymetrie píku a to jako faktor asymetrie AS, který je vyjádřen jako poměr šířky píku vzestupné (tP) k sestupné části píku (fP) nejčastěji v 5 nebo 10 % výšky píku:

HPLC.cz: Výpočet faktoru asymetrie

a dále tailing faktor T, který je vyjádřen jako šířka píku k dvojnásobku šířky píku vzestupné části fP v 5 % výšky píku:

HPLC.cz: Výpočet tailing faktoru

V případě, že pík chvostuje, pak faktor asymetrie nebo tailing faktor >1, v případě, že <1 pak dochází k frontování píku:

HPLC.cz: Schématické znázornění chromatografického píku

Pokud se počítá faktor asymetrie a tailing faktor v 5 % výšky pak mezi oběma existuje vztah:

HPLC.cz: Vztah mezi tailing faktorem a asymetrii v 5% výšky píku

Z tabulky je zřetelné jak se mění oba faktory:

HPLC.cz: Tabulka závislosti faktoru asymetrie a tailing faktoru