LCMS
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití
LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena. Obsah dostupný pod licencí CC BY-SA 4.0 Uveďte původ-Zachovejte licenci.
Autor
Česká chromatografická škola
Česká chromatografická škola
Našim cílem je propagace, šíření a podpora analytické chemie, především HPLC, GC a CE, jako základních separačních metod. Vzdělávání v oblasti separačních metod bychom chtěli pojmout jako kontinuální proces získávání a rozvoje vědomostí, intelektových schopností a praktických dovedností nad rámec obecného vzdělání.
Tagy
Článek
Akademie
LinkedIn Logo

Tipy a triky v HPLC: Vliv chromatografických podmínek na eluční charakteristiky separovaných látek

Čt, 13.1.2022
| Originální článek z: Česká chromatografická škola/Michal Douša
Které parametry nebo podmínky separace nejčastěji ovlivňují eluci Vašich analytů? Podívali jsme se na Teplotu, Složení mobilní fáze nebo Rozměry kolon.
<p>Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Tipy a triky v HPLC: Vliv chromatografických podmínek na eluční charakteristiky separovaných látek</p>

Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Tipy a triky v HPLC: Vliv chromatografických podmínek na eluční charakteristiky separovaných látek

Vliv teploty na eluční charakteristiky separovaných látek

Teplota má vliv na:
  • termodynamický aspekt chromatografického procesu
  • kinetický aspekt chromatografického procesu

Praktická ukázka ovlivnění separace acetonu, methylparabenu, ethylparabenu a propylparabenu:

HPLC.cz: Chromatografický záznam separace acetonu, methylparabenu, ethylparabenu a propylparabenu.HPLC.cz: Chromatografický záznam separace acetonu, methylparabenu, ethylparabenu a propylparabenu.

Termodynamický aspekt

Teplota má vliv na termodynamický aspekt z hlediska změny distribuční konstanty KD,obdobně pro kapacitní poměr k napíšeme:

HPLC.cz: Distribuční konstanty KD a kapacitní poměr kHPLC.cz: Distribuční konstanty KD a kapacitní poměr k

Z rovnice vyplývá, že se vzrůstající teplotou klesá distribuční konstanta KD a kapacitní poměr k (obrázek).

Kinetický aspekt

Teplota má vliv na velikost difúzních koeficientů, které jsou funkcí teploty a viskozity mobilní fáze:

HPLC.cz: Difúzní koeficientHPLC.cz: Difúzní koeficient

Z rovnice plyne, že zvýšením teploty roste účinnost chromatografické kolony klesá viskosita a zvyšují se difúzní koeficienty:

HPLC.cz: Eluční charakteristiky separace acetonu, methylparabenu, ethylparabenu a propylparabenu.HPLC.cz: Eluční charakteristiky separace acetonu, methylparabenu, ethylparabenu a propylparabenu.

Vysvětlivky:
  • index 3 – propylparaben; 2 – ethylparaben.
  • Červeně jsou označeny ty charakteristiky, které se mění se složením mobilní fáze.

Závěr

Zvýšením teploty:
  • klesá kapacitní poměr k (termodynamický aspekt) - zkracuje se doba analýzy t
  • dochází ke zvýšení účinnosti kolony n (kinetický aspekt)
  • má vliv na rozlišení R₁ι₂ podle toho zda převáží termodynamický nebo kinetický aspekt - nelze jednoznačně odhadnout)
  • dochází ke snížení tlakového spádu na koloně Dp (teplotní gradient DT)

Vliv složení mobilní fáze na eluční charakteristiky separovaných látek

Složení mobilní fáze má vliv na:
  • účinnost kolony
  • kapacitní poměr
  • retenční poměr
  • rozlišení
  • dobu analýzy
  • citlivost

Vliv složení mobilní fáze na eluční charakteristiky jsou uvedeny v tabulce:

HPLC.cz: Tabulka vlivu složení mobilní fáze na eluční charakteristikyHPLC.cz: Tabulka vlivu složení mobilní fáze na eluční charakteristiky

Vysvětlivky:
  • index 3 – propylparaben; 2 – ethylparaben.
  • Červeně jsou označeny ty charakteristiky, které se mění se složením mobilní fáze.

Vliv objemové frakce organického rozpouštědla j v mobilní fázi na kapacitní poměry solutů k byl popsán rovnicí uvedenou zde. Vyjdeme-li z této rovnice, pak pro retenční poměr r₁ι₂ (selektivitu) dostaneme:

HPLC.cz: Rovnice pro retenční poměrHPLC.cz: Rovnice pro retenční poměr

Z rovnice je zřejmé, že při stejných hodnotách m₁ a m₂ pro obě separované látky nezávisí selektivita na složení mobilní fáze a změnou složení mobilní fáze se selektivita neovlivní.

Z experimentálních údajů byly vypočteny následující rovnice:

  • Methylparaben: log k = 1,6995 - 0,0325.c ; r = -0,9978 ; Þkₐ = 50,1

  • Ethylparaben: log k = 2,2055 - 0,0361.c ; r = -0,9976 ; Þkₐ = 160,5

  • Propylparaben: log k = 2,8035 - 0,0409.c ; r = -0,9971 ; Þkₐ = 636,1

Při zpětném výpočtu retenčního poměru r₁ι₂ pro c = 50 % dostaneme hodnotu r₁ι₂ = 2,11 což se shoduje s experimentem r₁ι₂ = 2,13. Výhodou tohoto experimentu je, že nyní si můžeme predikovat kapacitní poměry k resp. retenční poměry r₁ι₂ pro jakékoliv složení mobilní fáze (v daném rozmezí objemových frakcí).

Příklady:

  1. Jaký bude kapacitní poměr k, a retenční poměr r₁ι₂ propylparabenu pro objemovou frakci methanolu j = 0,45 v mobilní fázi ?

Řešení: k = 9,18 a pro retenční poměr:

HPLC.cz: Příklad výpočtu retenčního poměruHPLC.cz: Příklad výpočtu retenčního poměru

  1. Pro jakou objemovou frakci methanolu j bude r₁ι₂ = 1,9?

Řešení:

HPLC.cz: Příklad výpočtu objemové frakceHPLC.cz: Příklad výpočtu objemové frakce

Závislost logaritmu kapacitního poměru na složení mobilní fáze je ukázán na obrázku.

Vliv rozměru kolony na eluční charakteristiky separovaných látek

Rozměry kolony (délka a vnitřní průměr) mají vliv na:
  • rozlišení (délka kolony)
  • šířku píku (délka kolony)
  • dobu analýzy (délka kolony)
  • mez stanovitelnosti (vnitřní průměr kolony)
  • tlakový spád na koloně (vnitřní průměr kolony)
  • objemový průtok mobilní fáze (vnitřní průměr kolony)

Rozlišení R₁ι₂

Účinnost kolony je úměrná čtverci délky kolony:

HPLC.cz: Účinnost kolonyHPLC.cz: Účinnost kolony

a se zvyšující se délkou kolony L roste účinnost kolony a současně i rozlišení:

HPLC.cz: RozlišeníHPLC.cz: Rozlišení

Šířka píku

Pro šířku píku můžeme napsat:

HPLC.cz: Šířka píkuHPLC.cz: Šířka píku

zkracující se délkou kolony L klesá šířka píku Yᵥ a zvyšuje se mez stanovitelnosti (citlivost).

Doba analýzy tₐ

Pro dobu analýzy platí:

HPLC.cz: Doba analýzyHPLC.cz: Doba analýzy

Doba analýzy tₐ klesá:
  • s klesajícími rozměry kolony (L,r)
  • se zvyšujícím se objemovým průtokem Fm
  • snižujícím se kapacitním poměrem kmax (zvyšující se eluční silou mobilní fáze).
Zkrácením délky kolony L:
  • zvýší se mez stanovitelnosti; citlivost
  • zkrátí se doba analýzy tₐ (sníží se spotřeba rozpouštědel)
  • sníží se tlakový spád na koloně Dp (teplotní gradient DT)
  • sníží se účinnost kolony n a rozlišení r₁ι₂

Mez stanovitelnosti

Absolutní mez stanovitelnosti můžeme vyjádřit jako zředění látky Z, ke kterému dojde během chromatografického procesu:

HPLC.cz: Zředění látkyHPLC.cz: Zředění látky

Zředění látky Z se vyjádří jako poměr šířky elučního píku (v objemových jednotkách) Yᵥ, k původnímu objemu vzorku VI.

Zředění vzorku Z se potlačí:
  • zvýšením účinnosti kolony n (použití náplní s malým zrněním, zvýšením eluční síly mobilní fáze)
  • zmenšením rozměrů kolony (to je její délky L a vnitřního průměru r) - toto je však na úkor snížení účinnosti kolony n
  • zvětšením nástřiku vzorku VI

Tlakový spád

Pro tlakový spád platí

HPLC.cz: Tlakový spádHPLC.cz: Tlakový spád

Při konstantní objemové rychlosti toku mobilní fáze Fm je tlakový spád na koloně Dp přímo úměrný délce kolony L a viskozitě mobilní fáze h a nepřímo úměrný čtverci průměru částeček náplně dp a čtverci vnitřního průměru kolony r².

Tlakový spád na koloně Dp bezprostředně souvisí s teplotním gradientem DT, který může na koloně vznikat průchodem mobilní fáze kolonou:

HPLC.cz: Teplotní gradientHPLC.cz: Teplotní gradient

Objemový průtok

Při zachování stejné střední lineární rychlosti mobilní fáze (u) je podle definice nutné snížit objemový průtok Fm a to v poměru čtverců průměru kolony:

HPLC.cz: Lineární rychlost mobilní fázeHPLC.cz: Lineární rychlost mobilní fáze

Snížením průměru kolony r ze 4,6 mm na 2,1mm se musí snížit objemový průtok asi 4,8 krát tj. z 1000 µl/min na 200 µl/min. Průtoky mobilní fáze se pak pohybují okolo 100 µl/min (dochází snížení spotřeby rozpouštědel).

Při zachování stejné účinnosti kolony n se objem pórů sorbentu snižuje v poměru čtverců průměru kolony r². To znamená i ve stejném poměru snížit dávkování vzorku na kolonu VI (možnost přetížení kolony).

Zmenšením průměru kolony r:
  • sníží se mez stanovitelnosti
  • sníží se spotřeba rozpouštědel
  • zvýší se tlakový spád na koloně Dp
  • zvýší se nároky na instrumentaci
  • zvýší se možnost přetížení kolony
Česká chromatografická škola
LinkedIn Logo
 

Mohlo by Vás zajímat

Orbitrap Excedion Pro hybrid mass spectrometer (Product specifications)

Brožury a specifikace
| 2025 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/Orbitrap
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření

Enhancing the efficiency and effectiveness of halogen and sulfur monitoring in challenging environmental and industrial samples

Brožury a specifikace
| 2025 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
Iontová chromatografie, Příprava vzorků
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření
Životní prostředí, Průmysl a chemie

PFAS Analysis Without Compromise

Brožury a specifikace
| 2025 | Agilent Technologies
Instrumentace
Spotřební materiál, Příprava vzorků
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí

Assessing the Purity of an Antisense Oligonucleotide Sample by LC/MS

Aplikace
| 2025 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

Chiral Amino Acid Analysis Using a Single Quadrupole Mass Spectrometer

Aplikace
| 2025 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Proteomika
 

Podobné články

Jak se liší SPE na normální fázi (NP) od SPE na reverzní fázi (RP)? Jak se rozhodnout, kterou zvolit?
Článek | Akademie

Jak se liší SPE na normální fázi (NP) od SPE na reverzní fázi (RP)? Jak se rozhodnout, kterou zvolit?

Jak se liší SPE na normální fázi (NP) od SPE na reverzní fázi (RP)? Jak se rozhodnout, kterou zvolit?
Phenomenex
tag
share
more
Ochrana zdraví dětí v kontextu chemických expozic
Článek | Zdraví

Ochrana zdraví dětí v kontextu chemických expozic

Vědci zapojeni do projektu ATHLETE z celé Evropy přijeli do Bruselu, aby informovali politiky o tom, jak mohou chránit zdraví dětí před chemickými expozicemi.
RECETOX - Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí
tag
share
more
Altium série webinářů - Webinar#6: Overcoming the Analytical Challenges When Testing for PFAS in Water (Pozvánka)
Článek | Nejbližší akce

Altium série webinářů - Webinar#6: Overcoming the Analytical Challenges When Testing for PFAS in Water (Pozvánka)

Nenechte si ujít poslední webinář ze série Altium webinářů, který bude věnován úskalím při analýze PFAS ve vodách.
Altium International
tag
share
more
Jste vědecky připraveni na novou houbařskou sezonu?
Článek | Osobnosti

Jste vědecky připraveni na novou houbařskou sezonu?

Houby pod mikroskopem i v lese. Chemik Roman Kysilka vzpomíná na výzkum psychotropních látek i na to, jak vědecké poznání ovlivňuje jeho pohled na houbaření.
Watrex Praha
tag
share
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Orbitrap Excedion Pro hybrid mass spectrometer (Product specifications)

Brožury a specifikace
| 2025 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/Orbitrap
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření

Enhancing the efficiency and effectiveness of halogen and sulfur monitoring in challenging environmental and industrial samples

Brožury a specifikace
| 2025 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
Iontová chromatografie, Příprava vzorků
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření
Životní prostředí, Průmysl a chemie

PFAS Analysis Without Compromise

Brožury a specifikace
| 2025 | Agilent Technologies
Instrumentace
Spotřební materiál, Příprava vzorků
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí

Assessing the Purity of an Antisense Oligonucleotide Sample by LC/MS

Aplikace
| 2025 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

Chiral Amino Acid Analysis Using a Single Quadrupole Mass Spectrometer

Aplikace
| 2025 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Proteomika
 

Podobné články

Jak se liší SPE na normální fázi (NP) od SPE na reverzní fázi (RP)? Jak se rozhodnout, kterou zvolit?
Článek | Akademie

Jak se liší SPE na normální fázi (NP) od SPE na reverzní fázi (RP)? Jak se rozhodnout, kterou zvolit?

Jak se liší SPE na normální fázi (NP) od SPE na reverzní fázi (RP)? Jak se rozhodnout, kterou zvolit?
Phenomenex
tag
share
more
Ochrana zdraví dětí v kontextu chemických expozic
Článek | Zdraví

Ochrana zdraví dětí v kontextu chemických expozic

Vědci zapojeni do projektu ATHLETE z celé Evropy přijeli do Bruselu, aby informovali politiky o tom, jak mohou chránit zdraví dětí před chemickými expozicemi.
RECETOX - Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí
tag
share
more
Altium série webinářů - Webinar#6: Overcoming the Analytical Challenges When Testing for PFAS in Water (Pozvánka)
Článek | Nejbližší akce

Altium série webinářů - Webinar#6: Overcoming the Analytical Challenges When Testing for PFAS in Water (Pozvánka)

Nenechte si ujít poslední webinář ze série Altium webinářů, který bude věnován úskalím při analýze PFAS ve vodách.
Altium International
tag
share
more
Jste vědecky připraveni na novou houbařskou sezonu?
Článek | Osobnosti

Jste vědecky připraveni na novou houbařskou sezonu?

Houby pod mikroskopem i v lese. Chemik Roman Kysilka vzpomíná na výzkum psychotropních látek i na to, jak vědecké poznání ovlivňuje jeho pohled na houbaření.
Watrex Praha
tag
share
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Orbitrap Excedion Pro hybrid mass spectrometer (Product specifications)

Brožury a specifikace
| 2025 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/Orbitrap
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření

Enhancing the efficiency and effectiveness of halogen and sulfur monitoring in challenging environmental and industrial samples

Brožury a specifikace
| 2025 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
Iontová chromatografie, Příprava vzorků
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření
Životní prostředí, Průmysl a chemie

PFAS Analysis Without Compromise

Brožury a specifikace
| 2025 | Agilent Technologies
Instrumentace
Spotřební materiál, Příprava vzorků
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí

Assessing the Purity of an Antisense Oligonucleotide Sample by LC/MS

Aplikace
| 2025 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

Chiral Amino Acid Analysis Using a Single Quadrupole Mass Spectrometer

Aplikace
| 2025 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Proteomika
 

Podobné články

Jak se liší SPE na normální fázi (NP) od SPE na reverzní fázi (RP)? Jak se rozhodnout, kterou zvolit?
Článek | Akademie

Jak se liší SPE na normální fázi (NP) od SPE na reverzní fázi (RP)? Jak se rozhodnout, kterou zvolit?

Jak se liší SPE na normální fázi (NP) od SPE na reverzní fázi (RP)? Jak se rozhodnout, kterou zvolit?
Phenomenex
tag
share
more
Ochrana zdraví dětí v kontextu chemických expozic
Článek | Zdraví

Ochrana zdraví dětí v kontextu chemických expozic

Vědci zapojeni do projektu ATHLETE z celé Evropy přijeli do Bruselu, aby informovali politiky o tom, jak mohou chránit zdraví dětí před chemickými expozicemi.
RECETOX - Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí
tag
share
more
Altium série webinářů - Webinar#6: Overcoming the Analytical Challenges When Testing for PFAS in Water (Pozvánka)
Článek | Nejbližší akce

Altium série webinářů - Webinar#6: Overcoming the Analytical Challenges When Testing for PFAS in Water (Pozvánka)

Nenechte si ujít poslední webinář ze série Altium webinářů, který bude věnován úskalím při analýze PFAS ve vodách.
Altium International
tag
share
more
Jste vědecky připraveni na novou houbařskou sezonu?
Článek | Osobnosti

Jste vědecky připraveni na novou houbařskou sezonu?

Houby pod mikroskopem i v lese. Chemik Roman Kysilka vzpomíná na výzkum psychotropních látek i na to, jak vědecké poznání ovlivňuje jeho pohled na houbaření.
Watrex Praha
tag
share
more
 

Mohlo by Vás zajímat

Orbitrap Excedion Pro hybrid mass spectrometer (Product specifications)

Brožury a specifikace
| 2025 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/Orbitrap
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření

Enhancing the efficiency and effectiveness of halogen and sulfur monitoring in challenging environmental and industrial samples

Brožury a specifikace
| 2025 | Thermo Fisher Scientific
Instrumentace
Iontová chromatografie, Příprava vzorků
Výrobce
Thermo Fisher Scientific
Zaměření
Životní prostředí, Průmysl a chemie

PFAS Analysis Without Compromise

Brožury a specifikace
| 2025 | Agilent Technologies
Instrumentace
Spotřební materiál, Příprava vzorků
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí

Assessing the Purity of an Antisense Oligonucleotide Sample by LC/MS

Aplikace
| 2025 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Farmaceutická analýza

Chiral Amino Acid Analysis Using a Single Quadrupole Mass Spectrometer

Aplikace
| 2025 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Proteomika
 

Podobné články

Jak se liší SPE na normální fázi (NP) od SPE na reverzní fázi (RP)? Jak se rozhodnout, kterou zvolit?
Článek | Akademie

Jak se liší SPE na normální fázi (NP) od SPE na reverzní fázi (RP)? Jak se rozhodnout, kterou zvolit?

Jak se liší SPE na normální fázi (NP) od SPE na reverzní fázi (RP)? Jak se rozhodnout, kterou zvolit?
Phenomenex
tag
share
more
Ochrana zdraví dětí v kontextu chemických expozic
Článek | Zdraví

Ochrana zdraví dětí v kontextu chemických expozic

Vědci zapojeni do projektu ATHLETE z celé Evropy přijeli do Bruselu, aby informovali politiky o tom, jak mohou chránit zdraví dětí před chemickými expozicemi.
RECETOX - Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí
tag
share
more
Altium série webinářů - Webinar#6: Overcoming the Analytical Challenges When Testing for PFAS in Water (Pozvánka)
Článek | Nejbližší akce

Altium série webinářů - Webinar#6: Overcoming the Analytical Challenges When Testing for PFAS in Water (Pozvánka)

Nenechte si ujít poslední webinář ze série Altium webinářů, který bude věnován úskalím při analýze PFAS ve vodách.
Altium International
tag
share
more
Jste vědecky připraveni na novou houbařskou sezonu?
Článek | Osobnosti

Jste vědecky připraveni na novou houbařskou sezonu?

Houby pod mikroskopem i v lese. Chemik Roman Kysilka vzpomíná na výzkum psychotropních látek i na to, jak vědecké poznání ovlivňuje jeho pohled na houbaření.
Watrex Praha
tag
share
more
Další projekty
GCMS
ICPMS
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití
LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena. Obsah dostupný pod licencí CC BY-SA 4.0 Uveďte původ-Zachovejte licenci.