Vliv chromatografických podmínek na eluční charakteristiky | LabRulez LCMS

Tipy a triky v HPLC: Vliv chromatografických podmínek na eluční charakteristiky separovaných látek

Čt, 13.1.2022
| Originální článek z: Česká chromatografická škola/Michal Douša
Které parametry nebo podmínky separace nejčastěji ovlivňují eluci Vašich analytů? Podívali jsme se na Teplotu, Složení mobilní fáze nebo Rozměry kolon.
Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Tipy a triky v HPLC: Vliv chromatografických podmínek na eluční charakteristiky separovaných látek

Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Tipy a triky v HPLC: Vliv chromatografických podmínek na eluční charakteristiky separovaných látek

Vliv teploty na eluční charakteristiky separovaných látek

Teplota má vliv na:
  • termodynamický aspekt chromatografického procesu
  • kinetický aspekt chromatografického procesu

Praktická ukázka ovlivnění separace acetonu, methylparabenu, ethylparabenu a propylparabenu:

HPLC.cz: Chromatografický záznam separace acetonu, methylparabenu, ethylparabenu a propylparabenu.

Termodynamický aspekt

Teplota má vliv na termodynamický aspekt z hlediska změny distribuční konstanty KD,obdobně pro kapacitní poměr k napíšeme:

HPLC.cz: Distribuční konstanty KD a kapacitní poměr k

Z rovnice vyplývá, že se vzrůstající teplotou klesá distribuční konstanta KD a kapacitní poměr k (obrázek).

Kinetický aspekt

Teplota má vliv na velikost difúzních koeficientů, které jsou funkcí teploty a viskozity mobilní fáze:

HPLC.cz: Difúzní koeficient

Z rovnice plyne, že zvýšením teploty roste účinnost chromatografické kolony klesá viskosita a zvyšují se difúzní koeficienty:

HPLC.cz: Eluční charakteristiky separace acetonu, methylparabenu, ethylparabenu a propylparabenu.

Vysvětlivky:
  • index 3 – propylparaben; 2 – ethylparaben.
  • Červeně jsou označeny ty charakteristiky, které se mění se složením mobilní fáze.

Závěr

Zvýšením teploty:
  • klesá kapacitní poměr k (termodynamický aspekt) - zkracuje se doba analýzy t
  • dochází ke zvýšení účinnosti kolony n (kinetický aspekt)
  • má vliv na rozlišení R₁ι₂ podle toho zda převáží termodynamický nebo kinetický aspekt - nelze jednoznačně odhadnout)
  • dochází ke snížení tlakového spádu na koloně Dp (teplotní gradient DT)

Vliv složení mobilní fáze na eluční charakteristiky separovaných látek

Složení mobilní fáze má vliv na:
  • účinnost kolony
  • kapacitní poměr
  • retenční poměr
  • rozlišení
  • dobu analýzy
  • citlivost

Vliv složení mobilní fáze na eluční charakteristiky jsou uvedeny v tabulce:

HPLC.cz: Tabulka vlivu složení mobilní fáze na eluční charakteristiky

Vysvětlivky:
  • index 3 – propylparaben; 2 – ethylparaben.
  • Červeně jsou označeny ty charakteristiky, které se mění se složením mobilní fáze.

Vliv objemové frakce organického rozpouštědla j v mobilní fázi na kapacitní poměry solutů k byl popsán rovnicí uvedenou zde. Vyjdeme-li z této rovnice, pak pro retenční poměr r₁ι₂ (selektivitu) dostaneme:

HPLC.cz: Rovnice pro retenční poměr

Z rovnice je zřejmé, že při stejných hodnotách m₁ a m₂ pro obě separované látky nezávisí selektivita na složení mobilní fáze a změnou složení mobilní fáze se selektivita neovlivní.

Z experimentálních údajů byly vypočteny následující rovnice:

  • Methylparaben: log k = 1,6995 - 0,0325.c ; r = -0,9978 ; Þkₐ = 50,1

  • Ethylparaben: log k = 2,2055 - 0,0361.c ; r = -0,9976 ; Þkₐ = 160,5

  • Propylparaben: log k = 2,8035 - 0,0409.c ; r = -0,9971 ; Þkₐ = 636,1

Při zpětném výpočtu retenčního poměru r₁ι₂ pro c = 50 % dostaneme hodnotu r₁ι₂ = 2,11 což se shoduje s experimentem r₁ι₂ = 2,13. Výhodou tohoto experimentu je, že nyní si můžeme predikovat kapacitní poměry k resp. retenční poměry r₁ι₂ pro jakékoliv složení mobilní fáze (v daném rozmezí objemových frakcí).

Příklady:

  1. Jaký bude kapacitní poměr k, a retenční poměr r₁ι₂ propylparabenu pro objemovou frakci methanolu j = 0,45 v mobilní fázi ?

Řešení: k = 9,18 a pro retenční poměr:

HPLC.cz: Příklad výpočtu retenčního poměru

  1. Pro jakou objemovou frakci methanolu j bude r₁ι₂ = 1,9?

Řešení:

HPLC.cz: Příklad výpočtu objemové frakce

Závislost logaritmu kapacitního poměru na složení mobilní fáze je ukázán na obrázku.

Vliv rozměru kolony na eluční charakteristiky separovaných látek

Rozměry kolony (délka a vnitřní průměr) mají vliv na:
  • rozlišení (délka kolony)
  • šířku píku (délka kolony)
  • dobu analýzy (délka kolony)
  • mez stanovitelnosti (vnitřní průměr kolony)
  • tlakový spád na koloně (vnitřní průměr kolony)
  • objemový průtok mobilní fáze (vnitřní průměr kolony)

Rozlišení R₁ι₂

Účinnost kolony je úměrná čtverci délky kolony:

HPLC.cz: Účinnost kolony

a se zvyšující se délkou kolony L roste účinnost kolony a současně i rozlišení:

HPLC.cz: Rozlišení

Šířka píku

Pro šířku píku můžeme napsat:

HPLC.cz: Šířka píku

zkracující se délkou kolony L klesá šířka píku Yᵥ a zvyšuje se mez stanovitelnosti (citlivost).

Doba analýzy tₐ

Pro dobu analýzy platí:

HPLC.cz: Doba analýzy

Doba analýzy tₐ klesá:
  • s klesajícími rozměry kolony (L,r)
  • se zvyšujícím se objemovým průtokem Fm
  • snižujícím se kapacitním poměrem kmax (zvyšující se eluční silou mobilní fáze).
Zkrácením délky kolony L:
  • zvýší se mez stanovitelnosti; citlivost
  • zkrátí se doba analýzy tₐ (sníží se spotřeba rozpouštědel)
  • sníží se tlakový spád na koloně Dp (teplotní gradient DT)
  • sníží se účinnost kolony n a rozlišení r₁ι₂

Mez stanovitelnosti

Absolutní mez stanovitelnosti můžeme vyjádřit jako zředění látky Z, ke kterému dojde během chromatografického procesu:

HPLC.cz: Zředění látky

Zředění látky Z se vyjádří jako poměr šířky elučního píku (v objemových jednotkách) Yᵥ, k původnímu objemu vzorku VI.

Zředění vzorku Z se potlačí:
  • zvýšením účinnosti kolony n (použití náplní s malým zrněním, zvýšením eluční síly mobilní fáze)
  • zmenšením rozměrů kolony (to je její délky L a vnitřního průměru r) - toto je však na úkor snížení účinnosti kolony n
  • zvětšením nástřiku vzorku VI

Tlakový spád

Pro tlakový spád platí

HPLC.cz: Tlakový spád

Při konstantní objemové rychlosti toku mobilní fáze Fm je tlakový spád na koloně Dp přímo úměrný délce kolony L a viskozitě mobilní fáze h a nepřímo úměrný čtverci průměru částeček náplně dp a čtverci vnitřního průměru kolony r².

Tlakový spád na koloně Dp bezprostředně souvisí s teplotním gradientem DT, který může na koloně vznikat průchodem mobilní fáze kolonou:

HPLC.cz: Teplotní gradient

Objemový průtok

Při zachování stejné střední lineární rychlosti mobilní fáze (u) je podle definice nutné snížit objemový průtok F*m* a to v poměru čtverců průměru kolony:

HPLC.cz: Lineární rychlost mobilní fáze

Snížením průměru kolony r ze 4,6 mm na 2,1mm se musí snížit objemový průtok asi 4,8 krát tj. z 1000 µl/min na 200 µl/min. Průtoky mobilní fáze se pak pohybují okolo 100 µl/min (dochází snížení spotřeby rozpouštědel).

Při zachování stejné účinnosti kolony n se objem pórů sorbentu snižuje v poměru čtverců průměru kolony r². To znamená i ve stejném poměru snížit dávkování vzorku na kolonu VI (možnost přetížení kolony).

Zmenšením průměru kolony r:
  • sníží se mez stanovitelnosti
  • sníží se spotřeba rozpouštědel
  • zvýší se tlakový spád na koloně Dp
  • zvýší se nároky na instrumentaci
  • zvýší se možnost přetížení kolony
Česká chromatografická škola
 

Mohlo by Vás zajímat

Waters XEVO G3 QTof

Brožury a specifikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Waters
Zaměření
---

Normal phase liquid chromatography assay for vitamin K1 isomers

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Agilent 6475 triple quadrupole LC/MS

Brožury a specifikace
| 2022 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
---

Shimadzu Liquid Chromatograph Mass Spectrometer LCMS-2050

Brožury a specifikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
---

Overcoming the challenges of liquid chromatography method transfer: A CDMO perspective

Technické články
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
---
 

Podobné články

Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Polární látky a solventy, Mez detekce a Stanovitelnosti, Asymetrie píků

Dnes se podíváme na několik různorodých témat jako LOD a LOQ, disociace polárních látek a jak ji potlačit, polární solventy a jejich empirická přenosová pravidla nebo asymetrie píku.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Chromatografická kolona a kapiláry, Životnost, Testování a deník chromatografické kolony

Jaké znáte typy HPLC kolon? Jak je správně uchovávat, instalovat a jak provést těsné spojení? Na čem závisí životnost kolony? Jak novou kolonu otestovat a vést její deník nebo použít kolonu s čipem?
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Velikosti nástřiku a mimokolonové příspěvky v HPLC

Na účinnost kolony má velikost nástřiku vliv zejména u mikrokolon. Objemy všech částí HPLC aparatury mají být co nejmenší, aby se zamezilo mimokolonovému rozmývání píků a tím snížení účinnosti kolony.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Problémy přenosu HPLC metod a jejich vhodné korekce

Jak prakticky postupovat při změně/přenosu HPLC metody mezi různými instrumenty nebo pracovišti rozebere další díl Tipů a Triků v HPLC.
 

Mohlo by Vás zajímat

Waters XEVO G3 QTof

Brožury a specifikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Waters
Zaměření
---

Normal phase liquid chromatography assay for vitamin K1 isomers

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Agilent 6475 triple quadrupole LC/MS

Brožury a specifikace
| 2022 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
---

Shimadzu Liquid Chromatograph Mass Spectrometer LCMS-2050

Brožury a specifikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
---

Overcoming the challenges of liquid chromatography method transfer: A CDMO perspective

Technické články
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
---
 

Podobné články

Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Polární látky a solventy, Mez detekce a Stanovitelnosti, Asymetrie píků

Dnes se podíváme na několik různorodých témat jako LOD a LOQ, disociace polárních látek a jak ji potlačit, polární solventy a jejich empirická přenosová pravidla nebo asymetrie píku.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Chromatografická kolona a kapiláry, Životnost, Testování a deník chromatografické kolony

Jaké znáte typy HPLC kolon? Jak je správně uchovávat, instalovat a jak provést těsné spojení? Na čem závisí životnost kolony? Jak novou kolonu otestovat a vést její deník nebo použít kolonu s čipem?
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Velikosti nástřiku a mimokolonové příspěvky v HPLC

Na účinnost kolony má velikost nástřiku vliv zejména u mikrokolon. Objemy všech částí HPLC aparatury mají být co nejmenší, aby se zamezilo mimokolonovému rozmývání píků a tím snížení účinnosti kolony.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Problémy přenosu HPLC metod a jejich vhodné korekce

Jak prakticky postupovat při změně/přenosu HPLC metody mezi různými instrumenty nebo pracovišti rozebere další díl Tipů a Triků v HPLC.
 

Mohlo by Vás zajímat

Waters XEVO G3 QTof

Brožury a specifikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Waters
Zaměření
---

Normal phase liquid chromatography assay for vitamin K1 isomers

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Agilent 6475 triple quadrupole LC/MS

Brožury a specifikace
| 2022 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
---

Shimadzu Liquid Chromatograph Mass Spectrometer LCMS-2050

Brožury a specifikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
---

Overcoming the challenges of liquid chromatography method transfer: A CDMO perspective

Technické články
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
---
 

Podobné články

Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Polární látky a solventy, Mez detekce a Stanovitelnosti, Asymetrie píků

Dnes se podíváme na několik různorodých témat jako LOD a LOQ, disociace polárních látek a jak ji potlačit, polární solventy a jejich empirická přenosová pravidla nebo asymetrie píku.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Chromatografická kolona a kapiláry, Životnost, Testování a deník chromatografické kolony

Jaké znáte typy HPLC kolon? Jak je správně uchovávat, instalovat a jak provést těsné spojení? Na čem závisí životnost kolony? Jak novou kolonu otestovat a vést její deník nebo použít kolonu s čipem?
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Velikosti nástřiku a mimokolonové příspěvky v HPLC

Na účinnost kolony má velikost nástřiku vliv zejména u mikrokolon. Objemy všech částí HPLC aparatury mají být co nejmenší, aby se zamezilo mimokolonovému rozmývání píků a tím snížení účinnosti kolony.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Problémy přenosu HPLC metod a jejich vhodné korekce

Jak prakticky postupovat při změně/přenosu HPLC metody mezi různými instrumenty nebo pracovišti rozebere další díl Tipů a Triků v HPLC.
 

Mohlo by Vás zajímat

Waters XEVO G3 QTof

Brožury a specifikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
Výrobce
Waters
Zaměření
---

Normal phase liquid chromatography assay for vitamin K1 isomers

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Agilent 6475 triple quadrupole LC/MS

Brožury a specifikace
| 2022 | Agilent Technologies
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
---

Shimadzu Liquid Chromatograph Mass Spectrometer LCMS-2050

Brožury a specifikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
---

Overcoming the challenges of liquid chromatography method transfer: A CDMO perspective

Technické články
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
HPLC
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
---
 

Podobné články

Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Polární látky a solventy, Mez detekce a Stanovitelnosti, Asymetrie píků

Dnes se podíváme na několik různorodých témat jako LOD a LOQ, disociace polárních látek a jak ji potlačit, polární solventy a jejich empirická přenosová pravidla nebo asymetrie píku.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Chromatografická kolona a kapiláry, Životnost, Testování a deník chromatografické kolony

Jaké znáte typy HPLC kolon? Jak je správně uchovávat, instalovat a jak provést těsné spojení? Na čem závisí životnost kolony? Jak novou kolonu otestovat a vést její deník nebo použít kolonu s čipem?
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Velikosti nástřiku a mimokolonové příspěvky v HPLC

Na účinnost kolony má velikost nástřiku vliv zejména u mikrokolon. Objemy všech částí HPLC aparatury mají být co nejmenší, aby se zamezilo mimokolonovému rozmývání píků a tím snížení účinnosti kolony.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Problémy přenosu HPLC metod a jejich vhodné korekce

Jak prakticky postupovat při změně/přenosu HPLC metody mezi různými instrumenty nebo pracovišti rozebere další díl Tipů a Triků v HPLC.
Další projekty
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití

LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena.