Tipy a triky v HPLC: Vliv chromatografických podmínek na eluční charakteristiky separovaných látek

Vliv teploty na eluční charakteristiky separovaných látek

Teplota má vliv na:

• termodynamický aspekt chromatografického procesu
• kinetický aspekt chromatografického procesu

Praktická ukázka ovlivnění separace acetonu, methylparabenu, ethylparabenu a propylparabenu:

HPLC.cz: Chromatografický záznam separace acetonu, methylparabenu, ethylparabenu a propylparabenu.

Termodynamický aspekt

Teplota má vliv na termodynamický aspekt z hlediska změny distribuční konstanty KD,obdobně pro kapacitní poměr k napíšeme:

HPLC.cz: Distribuční konstanty KD a kapacitní poměr k

Z rovnice vyplývá, že se vzrůstající teplotou klesá distribuční konstanta KD a kapacitní poměr k (obrázek).

Kinetický aspekt

Teplota má vliv na velikost difúzních koeficientů, které jsou funkcí teploty a viskozity mobilní fáze:

HPLC.cz: Difúzní koeficient

Z rovnice plyne, že zvýšením teploty roste účinnost chromatografické kolony klesá viskosita a zvyšují se difúzní koeficienty:

HPLC.cz: Eluční charakteristiky separace acetonu, methylparabenu, ethylparabenu a propylparabenu.

Vysvětlivky:

• index 3 – propylparaben; 2 – ethylparaben.
• Červeně jsou označeny ty charakteristiky, které se mění se složením mobilní fáze.

Závěr

Zvýšením teploty:

• klesá kapacitní poměr k (termodynamický aspekt) - zkracuje se doba analýzy tₐ
• dochází ke zvýšení účinnosti kolony n (kinetický aspekt)
• má vliv na rozlišení R₁ι₂ podle toho zda převáží termodynamický nebo kinetický aspekt - nelze jednoznačně odhadnout)
• dochází ke snížení tlakového spádu na koloně Dp (teplotní gradient DT)

Vliv složení mobilní fáze na eluční charakteristiky separovaných látek

Složení mobilní fáze má vliv na:

• účinnost kolony
• kapacitní poměr
• retenční poměr
• rozlišení
• dobu analýzy
• citlivost

Vliv složení mobilní fáze na eluční charakteristiky jsou uvedeny v tabulce:

HPLC.cz: Tabulka vlivu složení mobilní fáze na eluční charakteristiky

Vysvětlivky:

• index 3 – propylparaben; 2 – ethylparaben.
• Červeně jsou označeny ty charakteristiky, které se mění se složením mobilní fáze.

Vliv objemové frakce organického rozpouštědla j v mobilní fázi na kapacitní poměry solutů k byl popsán rovnicí uvedenou zde. Vyjdeme-li z této rovnice, pak pro retenční poměr r₁ι₂ (selektivitu) dostaneme:

HPLC.cz: Rovnice pro retenční poměr

Z rovnice je zřejmé, že při stejných hodnotách m₁ a m₂ pro obě separované látky nezávisí selektivita na složení mobilní fáze a změnou složení mobilní fáze se selektivita neovlivní.

Z experimentálních údajů byly vypočteny následující rovnice:

• Methylparaben: log k = 1,6995 - 0,0325.c ; r = -0,9978 ; Þkₐ = 50,1

• Ethylparaben: log k = 2,2055 - 0,0361.c ; r = -0,9976 ; Þkₐ = 160,5

• Propylparaben: log k = 2,8035 - 0,0409.c ; r = -0,9971 ; Þkₐ = 636,1

Při zpětném výpočtu retenčního poměru r₁ι₂ pro c = 50 % dostaneme hodnotu r₁ι₂ = 2,11 což se shoduje s experimentem r₁ι₂ = 2,13. Výhodou tohoto experimentu je, že nyní si můžeme predikovat kapacitní poměry k resp. retenční poměry r₁ι₂ pro jakékoliv složení mobilní fáze (v daném rozmezí objemových frakcí).

Příklady:

1. Jaký bude kapacitní poměr k, a retenční poměr r₁ι₂ propylparabenu pro objemovou frakci methanolu j = 0,45 v mobilní fázi ?

Řešení: k = 9,18 a pro retenční poměr:

HPLC.cz: Příklad výpočtu retenčního poměru

2. Pro jakou objemovou frakci methanolu j bude r₁ι₂ = 1,9?

Řešení:

HPLC.cz: Příklad výpočtu objemové frakce

Závislost logaritmu kapacitního poměru na složení mobilní fáze je ukázán na obrázku.

Vliv rozměru kolony na eluční charakteristiky separovaných látek

Rozměry kolony (délka a vnitřní průměr) mají vliv na:

• rozlišení (délka kolony)
• šířku píku (délka kolony)
• dobu analýzy (délka kolony)
• mez stanovitelnosti (vnitřní průměr kolony)
• tlakový spád na koloně (vnitřní průměr kolony)
• objemový průtok mobilní fáze (vnitřní průměr kolony)

Rozlišení R₁ι₂

Účinnost kolony je úměrná čtverci délky kolony:

HPLC.cz: Účinnost kolony

a se zvyšující se délkou kolony L roste účinnost kolony a současně i rozlišení:

HPLC.cz: Rozlišení

Šířka píku

Pro šířku píku můžeme napsat:

HPLC.cz: Šířka píku

zkracující se délkou kolony L klesá šířka píku Yᵥ a zvyšuje se mez stanovitelnosti (citlivost).

Doba analýzy tₐ

Pro dobu analýzy platí:

HPLC.cz: Doba analýzy

Doba analýzy tₐ klesá:

• s klesajícími rozměry kolony (L,r)
• se zvyšujícím se objemovým průtokem Fm
• snižujícím se kapacitním poměrem kmax (zvyšující se eluční silou mobilní fáze).

Zkrácením délky kolony L:

• zvýší se mez stanovitelnosti; citlivost
• zkrátí se doba analýzy tₐ (sníží se spotřeba rozpouštědel)
• sníží se tlakový spád na koloně Dp (teplotní gradient DT)
• sníží se účinnost kolony n a rozlišení r₁ι₂

Mez stanovitelnosti

Absolutní mez stanovitelnosti můžeme vyjádřit jako zředění látky Z, ke kterému dojde během chromatografického procesu:

HPLC.cz: Zředění látky

Zředění látky Z se vyjádří jako poměr šířky elučního píku (v objemových jednotkách) Yᵥ, k původnímu objemu vzorku VI.

Zředění vzorku Z se potlačí:

• zvýšením účinnosti kolony n (použití náplní s malým zrněním, zvýšením eluční síly mobilní fáze)
• zmenšením rozměrů kolony (to je její délky L a vnitřního průměru r) - toto je však na úkor snížení účinnosti kolony n
• zvětšením nástřiku vzorku VI

Tlakový spád

Pro tlakový spád platí

HPLC.cz: Tlakový spád

Při konstantní objemové rychlosti toku mobilní fáze Fm je tlakový spád na koloně Dp přímo úměrný délce kolony L a viskozitě mobilní fáze h a nepřímo úměrný čtverci průměru částeček náplně dp a čtverci vnitřního průměru kolony r².

Tlakový spád na koloně Dp bezprostředně souvisí s teplotním gradientem DT, který může na koloně vznikat průchodem mobilní fáze kolonou:

HPLC.cz: Teplotní gradient

Objemový průtok

Při zachování stejné střední lineární rychlosti mobilní fáze (u) je podle definice nutné snížit objemový průtok Fm a to v poměru čtverců průměru kolony:

HPLC.cz: Lineární rychlost mobilní fáze

Snížením průměru kolony r ze 4,6 mm na 2,1mm se musí snížit objemový průtok asi 4,8 krát tj. z 1000 µl/min na 200 µl/min. Průtoky mobilní fáze se pak pohybují okolo 100 µl/min (dochází snížení spotřeby rozpouštědel).

Při zachování stejné účinnosti kolony n se objem pórů sorbentu snižuje v poměru čtverců průměru kolony r². To znamená i ve stejném poměru snížit dávkování vzorku na kolonu VI (možnost přetížení kolony).

Zmenšením průměru kolony r:

• sníží se mez stanovitelnosti
• sníží se spotřeba rozpouštědel
• zvýší se tlakový spád na koloně Dp
• zvýší se nároky na instrumentaci
• zvýší se možnost přetížení kolony