Vliv chromatografických podmínek na eluční charakteristiky | LabRulez LCMS

Tipy a triky v HPLC: Vliv chromatografických podmínek na eluční charakteristiky separovaných látek

Čt, 13.1.2022
| Originální článek z: Česká chromatografická škola/Michal Douša
Které parametry nebo podmínky separace nejčastěji ovlivňují eluci Vašich analytů? Podívali jsme se na Teplotu, Složení mobilní fáze nebo Rozměry kolon.
Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Tipy a triky v HPLC: Vliv chromatografických podmínek na eluční charakteristiky separovaných látek

Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Tipy a triky v HPLC: Vliv chromatografických podmínek na eluční charakteristiky separovaných látek

Vliv teploty na eluční charakteristiky separovaných látek

Teplota má vliv na:
  • termodynamický aspekt chromatografického procesu
  • kinetický aspekt chromatografického procesu

Praktická ukázka ovlivnění separace acetonu, methylparabenu, ethylparabenu a propylparabenu:

HPLC.cz: Chromatografický záznam separace acetonu, methylparabenu, ethylparabenu a propylparabenu.

Termodynamický aspekt

Teplota má vliv na termodynamický aspekt z hlediska změny distribuční konstanty KD,obdobně pro kapacitní poměr k napíšeme:

HPLC.cz: Distribuční konstanty KD a kapacitní poměr k

Z rovnice vyplývá, že se vzrůstající teplotou klesá distribuční konstanta KD a kapacitní poměr k (obrázek).

Kinetický aspekt

Teplota má vliv na velikost difúzních koeficientů, které jsou funkcí teploty a viskozity mobilní fáze:

HPLC.cz: Difúzní koeficient

Z rovnice plyne, že zvýšením teploty roste účinnost chromatografické kolony klesá viskosita a zvyšují se difúzní koeficienty:

HPLC.cz: Eluční charakteristiky separace acetonu, methylparabenu, ethylparabenu a propylparabenu.

Vysvětlivky:
  • index 3 – propylparaben; 2 – ethylparaben.
  • Červeně jsou označeny ty charakteristiky, které se mění se složením mobilní fáze.

Závěr

Zvýšením teploty:
  • klesá kapacitní poměr k (termodynamický aspekt) - zkracuje se doba analýzy t
  • dochází ke zvýšení účinnosti kolony n (kinetický aspekt)
  • má vliv na rozlišení R₁ι₂ podle toho zda převáží termodynamický nebo kinetický aspekt - nelze jednoznačně odhadnout)
  • dochází ke snížení tlakového spádu na koloně Dp (teplotní gradient DT)

Vliv složení mobilní fáze na eluční charakteristiky separovaných látek

Složení mobilní fáze má vliv na:
  • účinnost kolony
  • kapacitní poměr
  • retenční poměr
  • rozlišení
  • dobu analýzy
  • citlivost

Vliv složení mobilní fáze na eluční charakteristiky jsou uvedeny v tabulce:

HPLC.cz: Tabulka vlivu složení mobilní fáze na eluční charakteristiky

Vysvětlivky:
  • index 3 – propylparaben; 2 – ethylparaben.
  • Červeně jsou označeny ty charakteristiky, které se mění se složením mobilní fáze.

Vliv objemové frakce organického rozpouštědla j v mobilní fázi na kapacitní poměry solutů k byl popsán rovnicí uvedenou zde. Vyjdeme-li z této rovnice, pak pro retenční poměr r₁ι₂ (selektivitu) dostaneme:

HPLC.cz: Rovnice pro retenční poměr

Z rovnice je zřejmé, že při stejných hodnotách m₁ a m₂ pro obě separované látky nezávisí selektivita na složení mobilní fáze a změnou složení mobilní fáze se selektivita neovlivní.

Z experimentálních údajů byly vypočteny následující rovnice:

  • Methylparaben: log k = 1,6995 - 0,0325.c ; r = -0,9978 ; Þkₐ = 50,1

  • Ethylparaben: log k = 2,2055 - 0,0361.c ; r = -0,9976 ; Þkₐ = 160,5

  • Propylparaben: log k = 2,8035 - 0,0409.c ; r = -0,9971 ; Þkₐ = 636,1

Při zpětném výpočtu retenčního poměru r₁ι₂ pro c = 50 % dostaneme hodnotu r₁ι₂ = 2,11 což se shoduje s experimentem r₁ι₂ = 2,13. Výhodou tohoto experimentu je, že nyní si můžeme predikovat kapacitní poměry k resp. retenční poměry r₁ι₂ pro jakékoliv složení mobilní fáze (v daném rozmezí objemových frakcí).

Příklady:

  1. Jaký bude kapacitní poměr k, a retenční poměr r₁ι₂ propylparabenu pro objemovou frakci methanolu j = 0,45 v mobilní fázi ?

Řešení: k = 9,18 a pro retenční poměr:

HPLC.cz: Příklad výpočtu retenčního poměru

  1. Pro jakou objemovou frakci methanolu j bude r₁ι₂ = 1,9?

Řešení:

HPLC.cz: Příklad výpočtu objemové frakce

Závislost logaritmu kapacitního poměru na složení mobilní fáze je ukázán na obrázku.

Vliv rozměru kolony na eluční charakteristiky separovaných látek

Rozměry kolony (délka a vnitřní průměr) mají vliv na:
  • rozlišení (délka kolony)
  • šířku píku (délka kolony)
  • dobu analýzy (délka kolony)
  • mez stanovitelnosti (vnitřní průměr kolony)
  • tlakový spád na koloně (vnitřní průměr kolony)
  • objemový průtok mobilní fáze (vnitřní průměr kolony)

Rozlišení R₁ι₂

Účinnost kolony je úměrná čtverci délky kolony:

HPLC.cz: Účinnost kolony

a se zvyšující se délkou kolony L roste účinnost kolony a současně i rozlišení:

HPLC.cz: Rozlišení

Šířka píku

Pro šířku píku můžeme napsat:

HPLC.cz: Šířka píku

zkracující se délkou kolony L klesá šířka píku Yᵥ a zvyšuje se mez stanovitelnosti (citlivost).

Doba analýzy tₐ

Pro dobu analýzy platí:

HPLC.cz: Doba analýzy

Doba analýzy tₐ klesá:
  • s klesajícími rozměry kolony (L,r)
  • se zvyšujícím se objemovým průtokem Fm
  • snižujícím se kapacitním poměrem kmax (zvyšující se eluční silou mobilní fáze).
Zkrácením délky kolony L:
  • zvýší se mez stanovitelnosti; citlivost
  • zkrátí se doba analýzy tₐ (sníží se spotřeba rozpouštědel)
  • sníží se tlakový spád na koloně Dp (teplotní gradient DT)
  • sníží se účinnost kolony n a rozlišení r₁ι₂

Mez stanovitelnosti

Absolutní mez stanovitelnosti můžeme vyjádřit jako zředění látky Z, ke kterému dojde během chromatografického procesu:

HPLC.cz: Zředění látky

Zředění látky Z se vyjádří jako poměr šířky elučního píku (v objemových jednotkách) Yᵥ, k původnímu objemu vzorku VI.

Zředění vzorku Z se potlačí:
  • zvýšením účinnosti kolony n (použití náplní s malým zrněním, zvýšením eluční síly mobilní fáze)
  • zmenšením rozměrů kolony (to je její délky L a vnitřního průměru r) - toto je však na úkor snížení účinnosti kolony n
  • zvětšením nástřiku vzorku VI

Tlakový spád

Pro tlakový spád platí

HPLC.cz: Tlakový spád

Při konstantní objemové rychlosti toku mobilní fáze Fm je tlakový spád na koloně Dp přímo úměrný délce kolony L a viskozitě mobilní fáze h a nepřímo úměrný čtverci průměru částeček náplně dp a čtverci vnitřního průměru kolony r².

Tlakový spád na koloně Dp bezprostředně souvisí s teplotním gradientem DT, který může na koloně vznikat průchodem mobilní fáze kolonou:

HPLC.cz: Teplotní gradient

Objemový průtok

Při zachování stejné střední lineární rychlosti mobilní fáze (u) je podle definice nutné snížit objemový průtok F*m* a to v poměru čtverců průměru kolony:

HPLC.cz: Lineární rychlost mobilní fáze

Snížením průměru kolony r ze 4,6 mm na 2,1mm se musí snížit objemový průtok asi 4,8 krát tj. z 1000 µl/min na 200 µl/min. Průtoky mobilní fáze se pak pohybují okolo 100 µl/min (dochází snížení spotřeby rozpouštědel).

Při zachování stejné účinnosti kolony n se objem pórů sorbentu snižuje v poměru čtverců průměru kolony r². To znamená i ve stejném poměru snížit dávkování vzorku na kolonu VI (možnost přetížení kolony).

Zmenšením průměru kolony r:
  • sníží se mez stanovitelnosti
  • sníží se spotřeba rozpouštědel
  • zvýší se tlakový spád na koloně Dp
  • zvýší se nároky na instrumentaci
  • zvýší se možnost přetížení kolony
Česká chromatografická škola
 

Mohlo by Vás zajímat

Routine Determination of Trifluoroacetic Acid (TFA) and Difluoroacetic Acid (DFA) in Surface and Drinking Water by Direct Injection Using UPLC-MS/MS

Aplikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Životní prostředí

Efficient Method Development on Pharmaceutical Impurities Using Single Quadrupole Mass Spectrometer

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Farmaceutická analýza

Identification of plastic additives in pharmaceutical packaging using a fully automated parallel extraction evaporator system and UHPLC-HRMS

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
Příprava vzorků, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/Orbitrap
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Farmaceutická analýza

How to prolong the lifetime of your HPLC column

Technické články
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
Spotřební materiál, LC kolony
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
---

Quantitative Determination of Fat-Soluble Vitamins in Infant Formula by LC-MS/MS Method with Supported Liquid Extraction (SLE)

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
Příprava vzorků, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství
 

Podobné články

Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Polární látky a solventy, Mez detekce a Stanovitelnosti, Asymetrie píků

Dnes se podíváme na několik různorodých témat jako LOD a LOQ, disociace polárních látek a jak ji potlačit, polární solventy a jejich empirická přenosová pravidla nebo asymetrie píku.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Velikosti nástřiku a mimokolonové příspěvky v HPLC

Na účinnost kolony má velikost nástřiku vliv zejména u mikrokolon. Objemy všech částí HPLC aparatury mají být co nejmenší, aby se zamezilo mimokolonovému rozmývání píků a tím snížení účinnosti kolony.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Problémy přenosu HPLC metod a jejich vhodné korekce

Jak prakticky postupovat při změně/přenosu HPLC metody mezi různými instrumenty nebo pracovišti rozebere další díl Tipů a Triků v HPLC.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Teorie toku mobilní fáze postkolonovým reaktorem

Derivatizace za kolonou (post-column derivatization) se někdy rovněž nazývá on-line derivatizace a jedná se o průtočný reaktor, který je umístěn za chromatografickou kolonu.
 

Mohlo by Vás zajímat

Routine Determination of Trifluoroacetic Acid (TFA) and Difluoroacetic Acid (DFA) in Surface and Drinking Water by Direct Injection Using UPLC-MS/MS

Aplikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Životní prostředí

Efficient Method Development on Pharmaceutical Impurities Using Single Quadrupole Mass Spectrometer

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Farmaceutická analýza

Identification of plastic additives in pharmaceutical packaging using a fully automated parallel extraction evaporator system and UHPLC-HRMS

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
Příprava vzorků, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/Orbitrap
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Farmaceutická analýza

How to prolong the lifetime of your HPLC column

Technické články
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
Spotřební materiál, LC kolony
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
---

Quantitative Determination of Fat-Soluble Vitamins in Infant Formula by LC-MS/MS Method with Supported Liquid Extraction (SLE)

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
Příprava vzorků, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství
 

Podobné články

Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Polární látky a solventy, Mez detekce a Stanovitelnosti, Asymetrie píků

Dnes se podíváme na několik různorodých témat jako LOD a LOQ, disociace polárních látek a jak ji potlačit, polární solventy a jejich empirická přenosová pravidla nebo asymetrie píku.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Velikosti nástřiku a mimokolonové příspěvky v HPLC

Na účinnost kolony má velikost nástřiku vliv zejména u mikrokolon. Objemy všech částí HPLC aparatury mají být co nejmenší, aby se zamezilo mimokolonovému rozmývání píků a tím snížení účinnosti kolony.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Problémy přenosu HPLC metod a jejich vhodné korekce

Jak prakticky postupovat při změně/přenosu HPLC metody mezi různými instrumenty nebo pracovišti rozebere další díl Tipů a Triků v HPLC.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Teorie toku mobilní fáze postkolonovým reaktorem

Derivatizace za kolonou (post-column derivatization) se někdy rovněž nazývá on-line derivatizace a jedná se o průtočný reaktor, který je umístěn za chromatografickou kolonu.
 

Mohlo by Vás zajímat

Routine Determination of Trifluoroacetic Acid (TFA) and Difluoroacetic Acid (DFA) in Surface and Drinking Water by Direct Injection Using UPLC-MS/MS

Aplikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Životní prostředí

Efficient Method Development on Pharmaceutical Impurities Using Single Quadrupole Mass Spectrometer

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Farmaceutická analýza

Identification of plastic additives in pharmaceutical packaging using a fully automated parallel extraction evaporator system and UHPLC-HRMS

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
Příprava vzorků, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/Orbitrap
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Farmaceutická analýza

How to prolong the lifetime of your HPLC column

Technické články
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
Spotřební materiál, LC kolony
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
---

Quantitative Determination of Fat-Soluble Vitamins in Infant Formula by LC-MS/MS Method with Supported Liquid Extraction (SLE)

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
Příprava vzorků, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství
 

Podobné články

Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Polární látky a solventy, Mez detekce a Stanovitelnosti, Asymetrie píků

Dnes se podíváme na několik různorodých témat jako LOD a LOQ, disociace polárních látek a jak ji potlačit, polární solventy a jejich empirická přenosová pravidla nebo asymetrie píku.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Velikosti nástřiku a mimokolonové příspěvky v HPLC

Na účinnost kolony má velikost nástřiku vliv zejména u mikrokolon. Objemy všech částí HPLC aparatury mají být co nejmenší, aby se zamezilo mimokolonovému rozmývání píků a tím snížení účinnosti kolony.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Problémy přenosu HPLC metod a jejich vhodné korekce

Jak prakticky postupovat při změně/přenosu HPLC metody mezi různými instrumenty nebo pracovišti rozebere další díl Tipů a Triků v HPLC.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Teorie toku mobilní fáze postkolonovým reaktorem

Derivatizace za kolonou (post-column derivatization) se někdy rovněž nazývá on-line derivatizace a jedná se o průtočný reaktor, který je umístěn za chromatografickou kolonu.
 

Mohlo by Vás zajímat

Routine Determination of Trifluoroacetic Acid (TFA) and Difluoroacetic Acid (DFA) in Surface and Drinking Water by Direct Injection Using UPLC-MS/MS

Aplikace
| 2022 | Waters
Instrumentace
LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Waters
Zaměření
Životní prostředí

Efficient Method Development on Pharmaceutical Impurities Using Single Quadrupole Mass Spectrometer

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
LC/MS, LC/SQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Farmaceutická analýza

Identification of plastic additives in pharmaceutical packaging using a fully automated parallel extraction evaporator system and UHPLC-HRMS

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
Příprava vzorků, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/Orbitrap
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Farmaceutická analýza

How to prolong the lifetime of your HPLC column

Technické články
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
Spotřební materiál, LC kolony
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
---

Quantitative Determination of Fat-Soluble Vitamins in Infant Formula by LC-MS/MS Method with Supported Liquid Extraction (SLE)

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
Příprava vzorků, LC/MS, LC/MS/MS, LC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství
 

Podobné články

Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Polární látky a solventy, Mez detekce a Stanovitelnosti, Asymetrie píků

Dnes se podíváme na několik různorodých témat jako LOD a LOQ, disociace polárních látek a jak ji potlačit, polární solventy a jejich empirická přenosová pravidla nebo asymetrie píku.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Velikosti nástřiku a mimokolonové příspěvky v HPLC

Na účinnost kolony má velikost nástřiku vliv zejména u mikrokolon. Objemy všech částí HPLC aparatury mají být co nejmenší, aby se zamezilo mimokolonovému rozmývání píků a tím snížení účinnosti kolony.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Problémy přenosu HPLC metod a jejich vhodné korekce

Jak prakticky postupovat při změně/přenosu HPLC metody mezi různými instrumenty nebo pracovišti rozebere další díl Tipů a Triků v HPLC.
Článek | Akademie

Tipy a triky v HPLC: Teorie toku mobilní fáze postkolonovým reaktorem

Derivatizace za kolonou (post-column derivatization) se někdy rovněž nazývá on-line derivatizace a jedná se o průtočný reaktor, který je umístěn za chromatografickou kolonu.
Další projekty
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití

LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena.