Tipy a triky v HPLC: Vliv chromatografických podmínek na eluční charakteristiky separovaných látek

Wikipedia/YassineMrabet: Tipy a triky v HPLC: Tipy a triky v HPLC: Vliv chromatografických podmínek na eluční charakteristiky separovaných látek
Vliv teploty na eluční charakteristiky separovaných látek
Teplota má vliv na:
- termodynamický aspekt chromatografického procesu
- kinetický aspekt chromatografického procesu
Praktická ukázka ovlivnění separace acetonu, methylparabenu, ethylparabenu a propylparabenu:
HPLC.cz: Chromatografický záznam separace acetonu, methylparabenu, ethylparabenu a propylparabenu.
Termodynamický aspekt
Teplota má vliv na termodynamický aspekt z hlediska změny distribuční konstanty KD,obdobně pro kapacitní poměr k napíšeme:
HPLC.cz: Distribuční konstanty KD a kapacitní poměr k
Z rovnice vyplývá, že se vzrůstající teplotou klesá distribuční konstanta KD a kapacitní poměr k (obrázek).
Kinetický aspekt
Teplota má vliv na velikost difúzních koeficientů, které jsou funkcí teploty a viskozity mobilní fáze:
HPLC.cz: Difúzní koeficient
Z rovnice plyne, že zvýšením teploty roste účinnost chromatografické kolony klesá viskosita a zvyšují se difúzní koeficienty:
HPLC.cz: Eluční charakteristiky separace acetonu, methylparabenu, ethylparabenu a propylparabenu.
Vysvětlivky:
- index 3 – propylparaben; 2 – ethylparaben.
- Červeně jsou označeny ty charakteristiky, které se mění se složením mobilní fáze.
Závěr
Zvýšením teploty:
- klesá kapacitní poměr k (termodynamický aspekt) - zkracuje se doba analýzy tₐ
- dochází ke zvýšení účinnosti kolony n (kinetický aspekt)
- má vliv na rozlišení R₁ι₂ podle toho zda převáží termodynamický nebo kinetický aspekt - nelze jednoznačně odhadnout)
- dochází ke snížení tlakového spádu na koloně Dp (teplotní gradient DT)
Vliv složení mobilní fáze na eluční charakteristiky separovaných látek
Složení mobilní fáze má vliv na:
- účinnost kolony
- kapacitní poměr
- retenční poměr
- rozlišení
- dobu analýzy
- citlivost
Vliv složení mobilní fáze na eluční charakteristiky jsou uvedeny v tabulce:
HPLC.cz: Tabulka vlivu složení mobilní fáze na eluční charakteristiky
Vysvětlivky:
- index 3 – propylparaben; 2 – ethylparaben.
- Červeně jsou označeny ty charakteristiky, které se mění se složením mobilní fáze.
Vliv objemové frakce organického rozpouštědla j v mobilní fázi na kapacitní poměry solutů k byl popsán rovnicí uvedenou zde. Vyjdeme-li z této rovnice, pak pro retenční poměr r₁ι₂ (selektivitu) dostaneme:
HPLC.cz: Rovnice pro retenční poměr
Z rovnice je zřejmé, že při stejných hodnotách m₁ a m₂ pro obě separované látky nezávisí selektivita na složení mobilní fáze a změnou složení mobilní fáze se selektivita neovlivní.
Z experimentálních údajů byly vypočteny následující rovnice:
-
Methylparaben: log k = 1,6995 - 0,0325.c ; r = -0,9978 ; Þkₐ = 50,1
-
Ethylparaben: log k = 2,2055 - 0,0361.c ; r = -0,9976 ; Þkₐ = 160,5
-
Propylparaben: log k = 2,8035 - 0,0409.c ; r = -0,9971 ; Þkₐ = 636,1
Při zpětném výpočtu retenčního poměru r₁ι₂ pro c = 50 % dostaneme hodnotu r₁ι₂ = 2,11 což se shoduje s experimentem r₁ι₂ = 2,13. Výhodou tohoto experimentu je, že nyní si můžeme predikovat kapacitní poměry k resp. retenční poměry r₁ι₂ pro jakékoliv složení mobilní fáze (v daném rozmezí objemových frakcí).
Příklady:
- Jaký bude kapacitní poměr k, a retenční poměr r₁ι₂ propylparabenu pro objemovou frakci methanolu j = 0,45 v mobilní fázi ?
Řešení: k = 9,18 a pro retenční poměr:
HPLC.cz: Příklad výpočtu retenčního poměru
- Pro jakou objemovou frakci methanolu j bude r₁ι₂ = 1,9?
Řešení:
HPLC.cz: Příklad výpočtu objemové frakce
Závislost logaritmu kapacitního poměru na složení mobilní fáze je ukázán na obrázku.
Vliv rozměru kolony na eluční charakteristiky separovaných látek
Rozměry kolony (délka a vnitřní průměr) mají vliv na:
- rozlišení (délka kolony)
- šířku píku (délka kolony)
- dobu analýzy (délka kolony)
- mez stanovitelnosti (vnitřní průměr kolony)
- tlakový spád na koloně (vnitřní průměr kolony)
- objemový průtok mobilní fáze (vnitřní průměr kolony)
Rozlišení R₁ι₂
Účinnost kolony je úměrná čtverci délky kolony:
HPLC.cz: Účinnost kolony
a se zvyšující se délkou kolony L roste účinnost kolony a současně i rozlišení:
HPLC.cz: Rozlišení
Šířka píku
Pro šířku píku můžeme napsat:
HPLC.cz: Šířka píku
zkracující se délkou kolony L klesá šířka píku Yᵥ a zvyšuje se mez stanovitelnosti (citlivost).
Doba analýzy tₐ
Pro dobu analýzy platí:
HPLC.cz: Doba analýzy
Doba analýzy tₐ klesá:
- s klesajícími rozměry kolony (L,r)
- se zvyšujícím se objemovým průtokem Fm
- snižujícím se kapacitním poměrem kmax (zvyšující se eluční silou mobilní fáze).
Zkrácením délky kolony L:
- zvýší se mez stanovitelnosti; citlivost
- zkrátí se doba analýzy tₐ (sníží se spotřeba rozpouštědel)
- sníží se tlakový spád na koloně Dp (teplotní gradient DT)
- sníží se účinnost kolony n a rozlišení r₁ι₂
Mez stanovitelnosti
Absolutní mez stanovitelnosti můžeme vyjádřit jako zředění látky Z, ke kterému dojde během chromatografického procesu:
HPLC.cz: Zředění látky
Zředění látky Z se vyjádří jako poměr šířky elučního píku (v objemových jednotkách) Yᵥ, k původnímu objemu vzorku VI.
Zředění vzorku Z se potlačí:
- zvýšením účinnosti kolony n (použití náplní s malým zrněním, zvýšením eluční síly mobilní fáze)
- zmenšením rozměrů kolony (to je její délky L a vnitřního průměru r) - toto je však na úkor snížení účinnosti kolony n
- zvětšením nástřiku vzorku VI
Tlakový spád
Pro tlakový spád platí
HPLC.cz: Tlakový spád
Při konstantní objemové rychlosti toku mobilní fáze Fm je tlakový spád na koloně Dp přímo úměrný délce kolony L a viskozitě mobilní fáze h a nepřímo úměrný čtverci průměru částeček náplně dp a čtverci vnitřního průměru kolony r².
Tlakový spád na koloně Dp bezprostředně souvisí s teplotním gradientem DT, který může na koloně vznikat průchodem mobilní fáze kolonou:
HPLC.cz: Teplotní gradient
Objemový průtok
Při zachování stejné střední lineární rychlosti mobilní fáze (u) je podle definice nutné snížit objemový průtok Fm a to v poměru čtverců průměru kolony:
HPLC.cz: Lineární rychlost mobilní fáze
Snížením průměru kolony r ze 4,6 mm na 2,1mm se musí snížit objemový průtok asi 4,8 krát tj. z 1000 µl/min na 200 µl/min. Průtoky mobilní fáze se pak pohybují okolo 100 µl/min (dochází snížení spotřeby rozpouštědel).
Při zachování stejné účinnosti kolony n se objem pórů sorbentu snižuje v poměru čtverců průměru kolony r². To znamená i ve stejném poměru snížit dávkování vzorku na kolonu VI (možnost přetížení kolony).
Zmenšením průměru kolony r:
- sníží se mez stanovitelnosti
- sníží se spotřeba rozpouštědel
- zvýší se tlakový spád na koloně Dp
- zvýší se nároky na instrumentaci
- zvýší se možnost přetížení kolony