Sledování změn obsahu ferulové kyseliny v pivovarských surovinách metodou UPLC s PDA detekcí

Práce se zabývá sledováním změn obsahu ferulové kyseliny v řadě ječmen-slad-sladina. Bylo analyzováno 21 vzorků odrůd ječmene, které pocházely ze 4 rozdílných lokalit. Ferulová kyselina byla ze vzorků ječmene a sladu po homogenizaci uvolněna alkalickou hydrolýzou a extrakt byl po úpravě pH přečištěn pomocí SPE. Pro analytické stanovení kyseliny ferulové v pivovarských surovinách byla použita optimalizovaná a validovaná ultrarychlá kapalinová chromatografie (UPLC-PDA). Obsah ferulové kyseliny v ječmeni se pohyboval v rozmezí 639,0 až 1555,8 mg.kg⁻¹, ve sladu 1441,7 až 2174,6 mg.kg⁻¹ a ve sladině 3,91 až 9,09 mg.l⁻¹.

1 ÚVOD

Rostlinné polyfenoly jsou amorfní látky, které jsou obsaženy v nejrůznějších částech rostliny – v kůře, dřevě, listech, plodech i kořenech. Společným rysem polyfenolů je, že obsahují jedno nebo více aromatických jader substituovaných hydroxylovými skupinami (1, 2). Polyfenolové látky, které jsou obsaženy v pivovarských surovinách a v pivu, se významně uplatňují v procesu zajištění a udržení kvality a stability piva. Tyto látky díky svým antioxidačním schopnostem ovlivňují senzorické vlastnosti a celkovou trvanlivost piva, hrají důležitou roli v technologii jeho výroby a v konečném stadiu pak přispívají k zdravotně pozitivnímu hodnocení piva jako zdroje přírodních antioxidantů.

Polyfenoly vyskytující se v pivovarnickém procesu lze rozdělit do dvou velkých skupin. Do první skupiny patří flavonoidy, které se dále dělí na flavany, antokyany a flavonoly. Druhou skupinu tvoří enolické kyseliny zahrnující deriváty benzoové kyseliny (salicylová kyselina, gentisová kyselina, p-hydroxybenzoová kyselina, protokatechová kyselina, gallová kyselina, vanilová kyselina a syryngová kyselina) a deriváty skořicové kyseliny (p-kumarová kyselina, kávová kyselina, ferulová kyselina a sinapová kyselina) (1).

Ferulová kyselina (4-hydroxy-3-methoxyskořicová) patří mezi hlavní vázané nízkomolekulární fenolové kyseliny v zrnu ječmene a vyskytuje se především v jeho vnějších vrstvách. V průběhu sladování se její obsah zvyšuje až dvojnásobně. Velký význam má antioxidační aktivita ferulové kyseliny v ječmeni a biochemickém procesu výroby piva. Spolu s ostatními polyfenolickými látkami se podílí na stabilitě a zachování kvalitativních znaků piva (1, 3).

2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

2.1 Chemikálie

Standard ferulové kyseliny, čistota 99% (Fluka); hydroxid sodný, (Merck); kyselina chlorovodíková (Sigma-Aldrich); kyselina fosforečná (Fluka); dihydrogenfosforečnan sodný (Fluka); acetonitril CHROMASOLV pro HPLC gradient grade (Sigma-Aldrich); methanol G CHROMASOLV gradient grade, ACS (Sigma-Aldrich).

2.2 Analyzované vzorky

Ječmen

Celková ferulová kyselina byla stanovena v 21 odrůdách ječmene (Tolar, Jersey, Malz, Prestige, Diplom, Calgary, Bojos, Radegast, Sebastian, Braemar, Xanadu, Blaník, Poet, Westminster, Aksamit, Spilka, Beatrix, Orthega, Bolina, Pribina, a Tocada) ze sklizně z roku 2006. Vzorky pocházely ze 4 pěstebních lokalit – Lednice, Věrovany, Čáslav a Hradec nad Svitavou.

Slad

Slady byly připraveny v mikrosladovně Sladařského ústavu VÚPS v Brně obvyklým způsobem dle metodiky EBC (5).

Sladina

Sladina byla připravena tzv. kongresním postupem, což je standardně provedený infuzní rmutovací postup s jemně rozemletým sladem (5).

2.3 Příprava standardu

Byl připraven zásobní roztok standardu ferulové kyseliny o koncentraci 100 mg.l⁻¹ v methanolu. Roztok byl uchováván v temnu při 5 °C a je stabilní po dobu 1 týdne. Byla připravena sedmibodová kalibrační křivka o koncentracích 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 mg.l⁻¹. Kalibrační křivka byla lineární v daném rozsahu s regresním koeficientem 0,9984.

2.4 Příprava vzorků

2.4.1 Ječmen, slad

K 1 g pomletého vzorku bylo přidáno 30 ml destilované vody. Po homogenizaci byl vzorek hydrolyzován 30 ml 2 mol.l⁻¹ hydroxidu sodného a třepán 1 hodinu na třepačce. K extraktu bylo přidáno 5,2 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a pH bylo upraveno pomocí 6 mol.l⁻¹ HCl na výslednou hodnotu pH 3. Extrakt byl doplněn destilovanou vodou na objem 100 ml. Poté byl převeden do centrifugační zkumavky a odstřeďován při 4000 min⁻¹ po dobu 15 minut. 1 ml supernatantu byl přečištěn pomocí SPE extrakce. Kolonka RP-102 Resin byla před použitím kondicionována 5 ml methanolu a poté 5 ml deionizované vody. Na kolonku byl nanesen 1ml vzorku. Kolonka byla promyta 5 ml vody. Následná eluce byla provedena 1,7 ml methanolu. Přečištěný extrakt byl přefiltrován pomocí teflonového membránového filtru (0,2 μm) a převeden do vialky.

2.4.2 Sladina

1 ml supernatantu, získaného postupem dle 2.4.1., byl přečištěn pomocí SPE extrakce. Kolonka RP-102 Resin byla před použitím kondicionována 5 ml methanolu a poté 5 ml deionizované vody. Na kolonku byl nanesen 1 ml vzorku. Kolonka byla promyta 50 ml deionizované vody. Následná eluce byla provedena 1,7 ml methanolu. Přečištěný extrakt byl přefiltrován pomocí teflonového membránového filtru (0,2 μm) a převeden do vialky.

2.5 Analytická metoda

Pro analytické stanovení celkové ferulové kyseliny v pivovarských surovinách (ječmen, slad, sladina) byl použit kapalinový chromatograf UPLC WATERS ACQUITY WATERS 2996 s PDA detektorem. Separace byla provedena na chromatografické koloně ACQUITY UPLC BEH C18. (2,1 mm × 100 mm s velikostí částic 1,7 μm) pomocí gradientové eluce. Mobilní fáze A byla 10 mmol.l⁻¹ fosfátový pufr upravený kyselinou fosforečnou na pH 3, mobilní fáze B byl acetonitril. Separace byla provedena při 40 °C při průtoku 0,5 ml.min⁻¹. Podmínky gradientové eluce byly následující: lineární od 5 do 60% B od 0 do 0.8 min, 60% B od 2 do 2.2 min, lineární od 60 do 5% B od 2.2 do 3 min. UV detekce byla při vlnové délce 300 nm. Délka analýzy byla 5 minut. Opakovatelnost (repeatability) stanovení ferulové kyseliny byla <5 % RSD. Výtěžnost SPE se pohybovala mezi 80–90 %.

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Kalibrační křivka pro stanovení celkové ferulové kyseliny u pevných matric byla lineární v rozsahu 170,0 až 2550,0 mg.kg⁻¹ (koncentrace ferulové kyseliny v reálném vzorku), regresní koeficient byl 0,9981, limit detekce 30 mg.kg⁻¹. Kalibrační křivka pro stanovení celkové ferulové kyseliny u kapalných matric byla lineární v rozsahu 1,7 až 25,5mg.l⁻¹ (koncentrace ferulové kyseliny v reálném vzorku), regresní koeficient 0,9964, limit detekce 0,5 mg.l⁻¹.

Jednotlivé odrůdy ječmene se liší v obsahu ferulové kyseliny. U 21 analyzovaných odrůd ječmene se obsah pohyboval mezi 639,0 až 1555,0 mg.kg⁻¹ (tab.1). Největší shody ve všech lokalitách dosáhla odrůda Malz (2,1 % RSD), nejvíce byly výsledky rozptýleny u odrůdy Xanadu (33,9 % RSD). Průměrný obsah ferulové kyseliny v ječmeni byl 935,1 mg.kg-1 (11,1 % RSD). Rozdíly obsahu ferulové kyseliny mohou být způsobeny především různými povětrnostními podmínkami v pěstebních lokalitách. Ve vzorcích ječmene pocházejících z lokality Lednice byly zjištěny nejvyšší hodnoty. Předpokládá se, že vzrůstající nadmořská výška může mít vliv na poměr volné a vázané ferulové kyseliny v ječmeni ve prospěch volné kyseliny (4, 6, 7).

Tab.1 Obsah ferulové kyseliny v ječmeni, sladu a sladině

Ve vzorcích sladů, vyrobených z analyzovaných odrůd ječmenů, se obsah ferulové kyseliny pohyboval mezi 1441,7 až 2174,6 mg.kg⁻¹ (tab. 1). Vyšší obsah ferulové kyseliny byl způsoben uvolněním vázané ferulové kyseliny z ječmene během sladovacího procesu. Největší shody ve všech lokalitách dosáhla odrůda Westminster (2,7 % RSD), nejvíce byly výsledky rozptýleny u odrůdy Prestige (15,0 % RSD). Průměrný obsah ferulové kyseliny ve sladu byl 1783,5 mg.kg⁻¹ (9,4 % RSD).

Nárůst obsahu ferulové kyseliny v řadě ječmen – slad se pohyboval od 7 do 164 %. Největší navýšení dosáhla odrůda Aksamit z lokality Věrovany, nejnižší nárůst obsahu ferulové kyseliny byl u odrůdy Blaník z lokality Lednice. Obecně lze říct, že z ječmene s vyšším obsahem ferulové kyseliny byl vyroben slad, kde došlo k menšímu nárůstu obsahu této kyseliny. Patrně to bylo způsobeno poměrem volné a vázané kyseliny v ječmeni.

Ve vzorcích jednotlivých sladin se obsah ferulové kyseliny pohyboval v rozmezí od 3,9 do 9,1 mg.l⁻¹ (viz tab. 1). Největší shody ve všech lokalitách dosáhla odrůda Diplom (9,6 % RSD), nejvíce byly výsledky rozptýleny u odrůdy Orthega (23,5 % RSD). Průměrný obsah kyseliny ferulové ve sladině byl 6,6 mg.l⁻¹ (14,9 % RSD).

4 ZÁVĚR

Byla zavedena nová metoda na stanovení ferulové kyseliny v pivovarských surovinách pomocí UPLC-PDA. Obsah kyseliny ferulové v ječmeni se pohyboval v rozmezí 639,0 až 1555,0 mg.kg⁻¹ , ve sladu 1441,7 až 2174,6 mg.kg⁻¹ a ve sladině 3,91 až 9,09 mg.l⁻¹.

Obsah ferulové kyseliny ve sladu byl vždy vyšší než obsah v ječmeni. Z ječmenů s vyšším obsahem ferulové kyseliny byly vyrobeny slady, kde došlo k menšímu nárůstu obsahu této kyseliny.