Obsah trans- a cis-iso-α-hořkých kyselin jako indikátor senzorické stability piva

Byl zkoumán obsah cis- a trans- izomerů iso-α-hořkých kyselin během skladování piv při 8 °C, 20 °C a 30 °C. Ke stanovení byla použita optimalizovaná metodika stanovení iso-α-hořkých kyselin podle Harmse a Nitzscheho. U všech vzorků piv byly prokázány úbytky trans- izomerů vlivem stárnutí piva, zatímco obsahy cis- izomerů zůstávaly téměř beze změn.V čerstvém pivu a po skladování byly u piv změřeny hodnoty lag time a T150.

1 ÚVOD

Pivo je nápoj po staletí oblíbený pro své organoleptické vlastnosti, schopnost tišit žízeň a celkovou téměř dokonalou iontovou a nutriční vyrovnanost. Nejdůležitějším posuzovatelem vlastností a kvality piva jsou spotřebitelé, jejichž požadavkům by se měla výroba přizpůsobit. Z tohoto hlediska je největší důraz kladen na senzorické vlastnosti a jejich stabilitu, která spotřebiteli zaručí stálou kvalitu piva po celou dobu garance. Typickou organoleptickou vlastností piva je jeho hořká chuť, která je způsobena hořkými látkami pocházejícími z chmelu. Pokles obsahu těchto látek v hotovém pivu je jedním z projevů stárnutí, a může mít nepříznivý vliv na chuť piva. Je tedy žádoucí skladovat pivo za podmínek, při kterých jsou tyto ztráty minimální. V pivu se hořké látky vyskytují převážně jako iso-α-hořké kyseliny, které vznikají během chmelovaru izomerizací α-hořkých kyselin (obr. 1). Jedná se o pivovarsky cenné látky, jejichž obsah v chmelu určuje jeho kvalitu, a je tedy důležité zabránit jejich úbytku během zpracování a skladování chmelu či chmelových výrobků. Nestálé α-hořké kyseliny velmi snadno podléhají chemickým přeměnám (oxidace, izomerizace aj.), které je možno v průběhu skladování omezit zabráněním styku se vzduchem a udržováním nízké teploty.

Obr. 1 Izomerace α-hořkých kyselin na cis- a trans-iso-α-hořké kyseliny (1)

METODIKA

2.1 Skladování piva

Skladovací pokusy stárnutí piva byly prováděny se vzorky lahvového piva. Jedná se o pasterovaný spodně kvašený světlý ležák stočený do 0,5 l zelených lahví. Použité pivo je typické nižším prokvašením s nižším obsahem alkoholu a vyšším zbytkovým extraktem v porovnání s ostatními pivy. Vyrábí se v maloobjemových měděných varnách třírmutovým postupem. Kvašení a dokvašování probíhá ve velkoobjemových CKT nádobách. Toto pivo patří k výrobkům vysoké standardní kvality s vyšší hořkostí a plností v senzorickém posouzení.Vzorky byly uloženy po dobu pěti měsíců při teplotách 8 °C, 20 °C a 30 °C bez přístupu světla.

2.2 Analytické metody

Kromě dále uváděných stanovení byla u sledovaného piva na začátku a na konci skladování určena původní koncentrace mladiny, skutečný extrakt, skutečné prokvašení, zdánlivý extrakt, zdánlivé prokvašení, alkohol, pH a barva. Dále byl každý měsíc stanoven obsah polyfenolů, anilinové číslo, obsah diacetylu, pentadionu, celkový obsah oxidu siřičitého a minimálně pěti hodnotiteli byl určen senzorický profil. Všechna tato stanovení byla provedena podle zavedených postupů popsaných v laboratorních metodách používaných při kontrole výroby piva (2).Hořkost piva byla měřena po extrakci isooktanem (2). Obsah a poměr cis- a transizomerů byl u iso-α-kyselin stanoven kapalinovou chromatografií (HPLC) (3). Skladované pivo bylo proměřováno ESR spektrometrií a byly stanoveny hodnoty lag-time a T-150 (4).

2.2.1 Stanovení jednotlivých iso-α-hořkých kyselin HPLC

Princip: Šest hlavních analogů iso-α-hořkých kyselin se rozdělí použitím vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) a spektrofotometricky se změří při vlnové délce 275 nm. Koncentrace jednotlivých látek se stanoví podle velikosti ploch jejich elučních pásů porovnáním se standardem.

2.3 Chemikálie a roztoky

• Acetonitril a methanol – Fluka, Švýcarsko
• Citrátový tlumivý roztok (9,5 ml 0,1 M kys. citronové + 41,5 ml 0,1 M citranu sodného doplnit do 100 ml vodou pro HPLC a upravit pH pomocí 50% NaOH na hodnotu pH = 7 a zfiltrovat přes membránový filtr s velikostí pórů 0,4 μm).
• Destilovaná voda upravená na zařízení Milli-Q Kalibrační standard: ICS- I1 (DCHA-Iso).

2.4 Přístroje a zařízení

• Kolonky pro SPE: AccuBOND C18 500 mg/3ml – Agilent Technologies
• Waters Aliance HPLC systém: separační modul 2695 a detektor diodového pole 2996, software Empower.

2.4.1 Podmínky stanovení

• Kolona: RP Nova-Pak C18 Waters
• Rozměr kolony: 250 x 4,6 mm, 4 μm
• Temperance kolony: 40 °C
• Detektor: PDA-UV Waters 2996 při 275 nm
• Eluenty:
  • A – acetonitril-methanol-citrátový pufr, 17:25:57 v/v/v
  • B – acetonitril-citrátový pufr, 55:45 v/v
• Nástřik na kolonu: 20 μm vzorku
• Gradient:

Gradient HPLC separace

2.4.2 Postup stanovení

Z piva se před analýzou odstraní bez ztráty pěny oxid uhličitý (20 minut na laboratorní třepačce). Z odplyněného piva se hořké látky oddělí extrakcí na pevné fázi. SPE kolonka se kondicionuje 5 ml methanolu následovanými 5 ml směsi methanol-voda-kyselina fosforečná 85% (60:40:0,1 v/v/v). Dále se přes kolonku zfiltruje 10 ml odplyněného vzorku piva a 2 ml vody na promytí. Poté se přes kolonku nechá deset sekund proudit vzduch na vysušení a nakonec se hořké látky vymyjí 2 ml směsi acetonitril-methanol-voda-kyselina fosforečná 85% (50:40:10:0,1 v/v/v). Po promíchání se eluent nastříkne na kolonu (3, 5, 6, 7, 8).

2.5 Senzorické hodnocení skladovaného piva

Stanovení senzorického profilu sledovaných vzorků piva bylo prováděno šestičlennou degustační komisí, která posuzovala intenzitu vůní a chutí a celkový subjektivní dojem (celková obliba). Pro hodnocení základních vlastností (hořkost, sladkost a plnost) byla použita devítibodová stupnice: 1-chybí, 2-právě postižitelná, 3-slabá, 4-pozorovatelná, 5-výrazná, 6-silná, 7-velmi silná, 8-mimořádně silná, 9-nadměrná. K hodnocení ostatních vlastností (esterová, svíravá, karamelová atd.) byla použita pětibodová stupnice: 1-nepatrná, 2-patrná, 3-postřehnutelná, 4-silná, 5-mimořádně silná. Celkový subjektivní dojem se hodnotil takto: 1-mimořádně špatné pivo, 9 až 10-ve všech ohledech skvělé pivo.

3 VÝSLEDKY

Vzorky piva jedné šarže byly skladovány při teplotách 8 °C, 20 °C a 30 °C. Jednotlivá analytická kritéria, především hořkost, obsah iso-α-hořkých kyselin a poměr jejich cis- a transizomerů, byla sledována od počátku v měsíčních intervalech. Stanovení původní koncentrace mladiny, alkoholu, skutečného extraktu, skutečného prokvašení, zdánlivého extraktu, zdánlivého prokvašení, barvy a pH bylo provedeno pouze na počátku a na konci skladovacího pokusu (tab. 1).

Tab. 1 Vliv teploty skladování na hodnotu základních parametrů piva

Podle očekávání se základní parametry během stárnutí piva neměnily. V závislosti na teplotě skladování byly zaznamenány změny barvy, jejíž hodnota se mírně zvyšuje u piva uloženého při 20 °C a výrazněji se zvyšuje u vzorku uloženého při 30 °C (tab. 1). Důvodem k nárůstu barvy mohla být přeměna kyslíku na peroxid vodíku s následnou oxidací látek extraktu na barevné sloučeniny v závislosti na fyzikálních vlastnostech piva. Zvýšení barvy mohlo být také způsobeno změnou melanoidinů, reakcí aminokyselin s cukry (9) a oxidací polyfenolů (10).

V závislosti na teplotě skladování došlo k malému snížení obsahu celkových polyfenolů v pivu. Polyfenoly v průběhu skladování polymerují vlivem oxidačních změn na sloučeniny zvyšující barvu, ale teplotou změněné polyfenoly ztrácejí antioxidační účinky v pivu a mohou kondenzovat s aminokyselinami na aldehydy dávající pivu starou chuť (11). Změny v chuťové stabilitě vlivem změn polyfenolů lze očekávat až při výrazné změně barvy piva.

Pomocí metody ESR byly měřeny hodnoty lag-time a T150. Během času hodnoty T150 stoupaly a hodnoty lag time klesly na nulu, což odpovídá úbytku oxidu siřičitého (tab. 2, tab. 4).

Tab. 2 Vliv teploty na hodnotu ESR v hotovém pivu během 4 měsíců skladování (lag time/T150)

Tab. 4 Vliv teploty na obsah celkového oxidu siřičitého v hotovém pivu během 4 měsíců skladování (mg/l)

Vliv teploty a doby skladování vyvolal u vzorků uložených při 8 °C mírný vzestup hodnoty anilinového čísla, na rozdíl od vzorků skladovaných při 20 °C a 30 °C, kde hodnota anilinového čísla rostla výrazněji. Po čtyřech měsících skladování vykazovalo pivo uložené při 30 °C třikrát vyšší anilinové číslo než pivo uložené při 20 °C (tab. 3). Hodnota anilinového čísla je dobrou veličinou pro sledování stárnutí piva (12, 13).

Tab. 3 Vliv teploty na hodnotu anilinového čísla v hotovém pivu během 4 měsíců skladování

Působením teploty 8 °C na hotové pivo nedošlo k výrazné změně obsahu oxidu siřičitého ani po čtyřech měsících skladování. Významný pokles obsahu SO2 nastal u piva uloženého při 20 °C, kde se jeho hodnota snížila na polovinu oproti původnímu množství. U vzorku piva uloženého při 30 °C klesl obsah SO2 po čtyřech měsících na nízkou hodnotu (tab. 4). Přítomnost SO2 v pivu má převážně příznivý vliv, protože působí jako přirozený antioxidant (14). Zpomaluje tvorbu staré chuti piva a koloidních zákalů. Příliš velká koncentrace (nad 30 mg/l) však negativně ovlivňuje chuť.

Vyšší teplota skladování měla také vliv na hodnoty vicinálních diketonů (diacetylu a 2,3-pentadionu), jejichž obsah výrazně klesl u piv skladovaných při 30 °C, méně při 20 °C a nejmenší pokles byl zjištěn u vzorků uložených při 8 °C (tab. 5, tab. 6). Tyto látky významně ovlivňují chuť piva v negativním smyslu, a jejich koncentrace by neměla přesáhnout 0,2 mg/l (15).

Tab. 5 Vliv teploty na obsah 2,3-pentadionu v hotovém pivu během 4 měsíců skladování (ppb)

Tab. 6 Vliv teploty na obsah diacetylu v hotovém pivu během 4 měsíců skladování (ppb)

Během skladování piva při 8 °C nedošlo ke změně jeho sledovaných senzorických vlastností, pouze po čtyřech měsících byla zaznamenána nepatrná oxidační a letinková chuť (tab. 7). Vzorky uložené při 20 °C vykázaly po čtyřech měsících skladování jen mírný pokles celkové obliby, ale již po měsíci se u nich vyskytla velmi slabá oxidační chuť a později i chuť letinková (tab. 8). Nejvýraznější změny nastaly u piva skladovaného při 30 °C, kde po čtyřech měsících značně poklesla celková obliba a došlo k většímu nárůstu intenzity oxidační i letinkové chuti (tab. 9).

Tab. 7 Senzorické hodnocení chuti piva v průběhu skladování při teplotě 8 °C

Tab. 8 Senzorické hodnocení chuti piva v průběhu skladování při teplotě 20 °C

Tab. 9 Senzorické hodnocení chuti piva v průběhu skladování při teplotě 30 °C

V průběhu skladování hotového piva za nepřístupu světla došlo působením teploty ke snížení hořkosti u všech sledovaných vzorků. U piv skladovaných při 8 °C byl pokles hořkosti 11%, při 20 °C již 16% a při 30 °C dokonce 22% (tab. 10). Hořkost piva se úměrně snížila v závislosti na teplotě skladování.

Tab. 10 Vliv teploty na změnu celkové hořkosti hotového piva během 5 měsíců skladování (JH)

Skladováním hotového piva při 8 °C došlo ke snížení obsahu iso-α-hořkých kyselin o 7 %, při 20 °C klesl obsah iso-α-hořkých kyselin o 12 % a při teplotě 30 °C o 15 %. Celkový pokles obsahu iso-α-hořkých kyselin byl výraznější při vyšších teplotách skladování (tab. 11, obr. 2).

Tab. 11 Vliv teploty na změnu obsahu iso-α-hořkých kyselin v hotovém pivu během 5 měsíců skladování (mg/l)

Obr. 2 Závislost změny obsahu iso-α-hořkých kyselin v pivu na teplotě skladování

Během skladování hotového piva byl pozorován rozdíl v rychlosti úbytku jednotlivých isohumulonů. V závislosti na teplotě a době skladování došlo k poklesu obsahu trans- izomerů iso-α-hořkých kyselin, zatímco obsah cis- izomerů se téměř nezměnil. K největším změnám došlo u vzorků skladovaných při teplotě 30 °C, které již po dvou měsících skladování obsahovaly stejný poměr cis- a trans-izomerů jako pivo skladované při 8 °C po dobu pěti měsíců (tab. 12).

Tab. 12 Vliv teploty na změnu poměru cis- a trans-izomerů iso-α-hořkých kyselin v pivu během pěti měsíců skladování (%)

Ve výsledcích měření je obsah cis- a transizomerů uváděn v procentech, která odpovídají jejich zastoupení ve směsi šesti hlavních stereoizomerů iso-α-hořkých kyselin obsažených ve sledovaném vzorku piva (obr. 3).

Obr. 3 Poměr cistrans iso-α-hořkých kyselin během skladovaní piva

4 ZÁVĚR

• Skladováním hotového piva při teplotě 30 °C po dobu čtyř měsíců došlo k mírnému zvýšení barvy. U vzorků uložených při teplotě 8 °C a 20 °C se hodnoty barvy nezměnily.

• Během skladování se odpovídajícím způsobem měnily hodnoty lag time/T150.

• Vlivem teploty skladování piva došlo během čtyř měsíců ke snížení obsahu oxidu siřičitého, přičemž jeho ztráty jsou největší u piv skladovaných při teplotě 30 °C. U vzorků uložených při teplotě 20 °C došlo po čtyřech měsících ke snížení obsahu oxidu siřičitého o 50 %.

• Hořké látky piva jsou stabilnější při nižších teplotách.

• V průběhu stárnutí hotového piva byl zaznamenán úbytek iso-α-hořkých kyselin, a to hlavně jejich trans-izomerů, který byl nejvýraznější u vzorků uchovávaných při teplotě 30 °C.

• Poměr cis/trans se během skladování piva zvyšuje, obsah trans-iso-α-hořkých kyselin se během 12měsíčního skladování při 20 °C snižuje asi na polovinu původního množství.

• Vhodnou veličinou pro sledování stárnutí piva je hodnota anilinového čísla, která se skladováním piva po dobu čtyř měsíců při teplotě 8 °C příliš nezvýšila, zatímco u vzorků uložených při teplotě 20 °C se jeho hodnota razantně zvýšila. Vzorky skladované při teplotě 30 °C měly hodnotu anilinového čísla téměř třikrát vyšší než vzorky skladované při teplotě 20 °C.

• Hotové pivo skladované čtyři měsíce při teplotě 8 °C mělo stále dobrou pitelnost a zachovalo si své velmi dobré senzorické hodnocení. Podobně tomu bylo u vzorku piva uloženého při teplotě 20 °C. Pivo skladované při teplotě 30 °C již mělo znatelně sníženou pitelnost a vykazovalo střední oxidační a letinkovou chuť.

• Metoda stanovení poměru obsahu cisa trans-izomerů iso-α-kyselin je vhodná metoda pro zhodnocení stavu senzorické stability piva.