Současné stanovení iso-alfa kyselin ve formě jejich cis- a trans- forem a tetrahydroiso-alfa kyselin

Vypracovaná metoda umožňuje i bez použití komplikovaných mobilních fází velice šetrným způsobem bez použití pufrů vedle sebe stanovit stereoisomerní formy iso-alfa kyselin a zároveň stanovit koncentraci případně přítomných tetrahydroiso-alfa kyselin jejich separací na koloně s reverzní fází C18. Jednotlivé skupiny látek se eluují v oddělených skupinách. Zbytky alfa kyselin, které nepřešly na iso-alfa kyseliny, stanovení v podstatě neruší.

1 ÚVOD

Při varním procesu alfa hořké kyseliny přecházejí na iso-alfa kyseliny zodpovědné za hořkou chuť piva. Iso-alfa kyseliny jsou formovány do dvou prostorových isomerů: cis- a trans-, a to ve prospěch cis- formy (poměr cis-/trans- forem bývá 68/32) (1). Během stárnutí piva je i forma cis- stabilnější na rozdíl od formy trans-, která podléhá snadněji oxidačním reakcím vedoucím k tvorbě těkavých sloučenin, včetně 2-ketonů, které dále podléhají kondenzačním reakcím aldolového typu s aldehydy. Vznikající sloučeniny podstatně ovlivňují senzorické vlastnosti piva. Je proto důležité sledovat souvislosti nejen mezi počáteční přeměnou alfa-kyselin na iso-alfa kyseliny, ale také dále sledovat koncentrace iso-alfa kyselin ve vyrobeném pivu a jejich stabilitu během skladování (2). Sledování jednotlivých forem cis a trans- iso-alfa kyselin má význam pro sledování stárnutí piva, kdy forma trans-, která je náchylnější k oxidaci, vypovídá také o časové stabilitě hořkosti piva.

Problém úbytku iso-alfa kyselin a stability hořkosti piva může být řešen přidáváním stabilních hydrogenovaných iso-alfa kyselin. V některých státech EU se proto redukované iso-alfa-kyseliny (zejména tetrahydroiso-alfa-kyseliny) ve formě komerčních preparátů do piva přidávají.

Dosud používaná HPLC metoda EBC 7.9 pro stanovení iso-alfa kyselin v pivu nebo v isomerizovaných chmelích neumožňuje rozlišení jednotlivých cis- a trans-stereoisomerů iso-alfa kyselin. Je proto snahou mnoha autorů vypracovat postupy, které by umožnily nejen rozlišení jednotlivých forem iso-alfa kyselin, ale i identifikovat jednotlivé složky přidávaných hydrogenovaných iso-alfa kyselin (3).

Cílem této práce bylo vypracovat metodu pro rozlišení cis- a transforem iso-alfa kyselin a jejich současné stanovení vedle případně přítomných tetrahydroiso-alfa kyselin. Příprava vzorku k analýze vychází z předchozí práce (4).

2 MATERIÁL A METODY

2.1 Extrakce iso-alfa kyselin

5ml odpěněného piva (odpěnění za pomocí ultrazvuku) se po opadnutí pěny nanese na kondicionovanou extrakční kolonku (STRATA X 33 μm/60 mg – Phenomenex).

Kondicionace: 1,5ml methanolu (Sigma Aldrich), potom 1,5ml H2O (ultračistá, Millipore).

Po průchodu piva kolonkou se tato promyje 1,5 ml 5% vodným roztokem methanolu za účelem odstranění polárnějších sloučenin. Potom se kolonka vysuší pod proudem dusíku a vyeluuje se do odměrné baňky o objemu 5 ml methanolem. Methanolem se doplní po značku a promíchá.

Z takto upraveného vzorku se na kolonu nastřikuje 10 μl.

2.2 Chromatografická separace a stanovení

K analýze byla zvolena kolona s reverzní fází (Alltima C18, 5 μm, 150x4,6 mm, Alltech) s předkolonkou C18 4x3 mm (Phenomenex).

Mobilní fáze je dvousložková: A je ultračistá voda (Millipore) s obsahem max.5 ppb organických látek, okyselená kyselinou fosforečnou na hodnotu pH 2,8, B je acetonitril (ACN) kvality gradient grade (Sigma Aldrich).

Použitý gradient pro separaci: 0. min. 52% ACN, 40. min 72% ACN.

Analýza trvá 40 minut s ekvilibračním časem 15 minut.

Jednotlivé složky byly detekovány v oblasti UV, v případě iso-alfa kyselin při 275 nm, v případě tetrahydro-iso-alfa kyselin při 253 nm.

Teplota kolony byla 35 °C, průtok byl 1,5 ml/min a nástřik 10 μl.

K analýze byl použit stavebnicový kapalinový chromatograf SpectraSYSTEM (TSP, USA) s UV detekcí s diodovým polem. Sběr dat a vyhodnocení byly zajištěny chromatografickým softwarem ChromQuest pro Windows NT.

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Iso-alfa kyseliny byly eluovány v 6 elučních zónách, kde 3 pásy odpovídaly trans – formám co-humulonu, n-humulonu a ad-humulonu a 3 pásy cis – formám co-humulonu, n-humulonu a ad-humulonu. Odděleně za skupinou elučních zón iso-alfa kyselin byly eluovány tetrahydroiso-alfa kyseliny (obr. 1).

Obr. 1 Chromatogram stereoisomerů iso-alfa kyselin a tetrahydroiso-alfa kyselin (T1-T5)

Při popsaných separačních podmínkách byly tetrahydro-iso-alfa kyseliny eluovány pouze v 5 zónách. V oblasti tetrahydroiso-alfa kyselin eluují též alfa kyseliny, jejich případnou přítomnost ve vzorku musíme předpokládat (obr. 2).

Obr. 2 Chromatogram stereoisomerů iso-alfa kyselin a tetrahydroiso-alfa kyselin společně (T1-T5) s alfa kyselinami.

Pík označený T4 za těchto separačních podmínek koeluuje s jednou z prostorových forem odpovídající poslednímu píku T5.

Alfa kyseliny eluují ve 2 výraznějších zónách, které neinterferují s tetrahydro-iso-alfa kyselinami, a v jedné nevýrazné zóně, která vykazuje částečný překryv s poslední zónou tetrahydroiso-alfa kyselin. Tato skutečnost nebrání při kvalitativním důkazu přítomnosti tetrahydro-iso-alfa kyselin vedle iso-alfa-kyselin, avšak při kvantitativním stanovení by měla být tato skutečnost zahrnuta do nejistoty stanovení.

Metoda byla odzkoušena vzhledem ke stanovení cis-a trans- forem iso-alfa kyselin na řadě výzkumných vzorků a některých vzorků z obchodní sítě. U některých zakoupených vzorků piv byla nalezena při HPLC analýze retenční shoda píků s tetrahydroiso-alfa kyselinami (obr. 3). Vzhledem k relativní hořkosti tetrahydroiso-alfa kyselin 1,5 - 1,9 (relativní hořkost iso-alfa kyselin je 1,00) (1,5) může již přídavek několika mg/l tetrahydroiso-alfa kyselin zlepšovat senzorické vlastnosti piva. Například ve studii sledování stability trans-iso-alfa hořkých kyselin (5) a kontroly hořkosti byly nalezeny v zahraničních ležáckých pivech již hodnoty od 2,9 mg/l přidaných tetrahydroiso-alfa kyselin pro zachování hořkosti během jejich skladování.

Obr. 3 Chromatogram iso-alfa kyselin, tetrahydro-iso-alfa kyselin a alfa-kyselin ve vzorku zakoupeného piva

Jelikož analyzované iso-alfa kyseliny a tetrahydroiso-alfa kyseliny eluují v šesti resp. pěti elučních zónách, jsou při kvantitativním vyhodnocení použity odezvové faktory vypočítané jako poměr koncentrace standardu (mg/l) a součtu ploch všech píků příslušného standardu. Jedná se o kalibraci konvenčně používanou v pivovarství pro stanovení iso-alfa kyselin (metoda EBC 7.9).

Mez stanovení je podstatně ovlivněna kvalitou detektoru, tedy jeho poměrem signálu k šumu.