Identifikace metamfetaminu ve vlasech metodou mikroextrakce na pevnou fázi v kombinaci s kapilární plynovou chromatografií a hmotnostní spektrometrií

V klinické a soudní toxikologii byla vyvinuta metoda analýzy drog ve vlasech, která je považována za významný nástroj pro rozlišení mezi okamžitým a dlouhodobým (chronickým) užíváním drog. Chronické užívání drog může postupně zvyšovat škodlivé účinky na lidský organismus a také významně přispívat k rozvoji jinak doposud latentních chorob. Analýza krve či moči na přítomnost drog neposkytuje dostatečné informace o historii užívání toxických látek určitou osobou, výsledky těchto rozborů nemohou být vhodně korelovány s toxickými účinky. Cílem studie bylo prokázat význam analýzy vlasů v případech zneužívání metamfetaminu. Analýza byla zacílena na přítomnost metamfetaminu a jeho hlavního metabolitu amfetaminu ve vlasové hmotě. Analýza byla prováděna metodou SPME/GC-MS a na jejím základě byl navržen jednoduchý algoritmus pro rozhodnutí o negativním či pozitivním výsledku analýzy.

Úvod

Vlasy, případně podobný materiál (chlupy, srst) představují unikátní polouzavřený systém, do něhož se prostřednictvím periferního tělního oběhu dlouhodobě ukládají cizorodé látky, které byly přechodně přítomny v krvi. Ukládání probíhá v cca 1,5 mm zóně ve vrstvě zárodečných buněk, před jejich keratinizací. Uložené látky v keratinizovaných (již neaktivních) buňkách pak postupují ve směru růstu vlasu a vystupují nad pokožku. Ve vlasu je tedy možné detekovat řadu kriminalisticky významných látek, včetně drog, léčiv a jedů i dlouho poté, co zevnitř organismu vymizely. Analýzy látek z vlasů se tedy provádějí především z forensních důvodů, kdy hledáme odpověď na otázky:

• zda užívala dotyčná osoba nějaké látky
• jaké látky to byly
• jednalo se o příležitostné, pravidelné nebo masivní užití
• kdy byla dotyčná látka užita (podle rychlosti růstu vlasů v normální růstové fázi).

Výsledky analýz vlasů mohou pomoci mj. v případech, kdy je třeba rozhodnout, zda daná osoba je závislá na OPL a na jaké. Často se jedná o nezletilé a mladistvé osoby a je třeba posoudit případnou trestní odpovědnost dalších osob. Může jít i o posouzení toho, zda v určitém období, rozhodujícím pro spáchaný delikt, zneužívala suspektní osoba OPL a zda to mohlo ovlivnit její jednání. U masivních nálezů toxických látek lze zpětně posoudit, zda byla příslušná osoba někdy v minulosti intoxikována či omámena.

Do vlasů se látky mohou ukládat jen v případě, že vlas je v aktivní růstové (anagenní) fázi; tato rychlost růstu (řádově asi 1 cm za měsíc) může být typově a individuálně rozdílná a existují v ní i sezónní změny. Určité procento vlasů přetrvává v neaktivním stavu (po zastavení růstu v katagenní fázi a v odumřelém stavu) jako součást pokrývky vlasů a další látky se do nich už neukládají.

Primárně jde o přestup látek z periferního krevního oběhu z kapilární cévky vyživující vrstvu zárodečných buněk vlasu (matrix). Intenzita přestupu je rozdílná pro různé typy látek a nemusí být pro některé látky dostatečná. Příkladem mohou být kannabinoidy, zejména THC a jeho metabolit THC-COOH, jejichž analýza z vlasů je tak vždy komplikovaná.

Jsou popsány i „parazitní“ způsoby přestupu látek do vlasu z potu a z kožního mazu. Mazová žláza ústí do vlasového váčku v zanořené části vlasu a může ovlivnit zejména transport lipofilních látek, zatímco z potu snadněji přestupují látky hydrofilní. Není vyloučen ani transport látek v nadkožní části vlasu, zvlášť když je poškozena kutikula vlasu, zejména po kadeřnických procedurách. Potenciální cílové látky tak částečně mohou pronikat z okolního prostředí dovnitř a vnikat případně až do vlasového kanálku a naopak uložené látky mohou difundovat a být postupně vymývány. Zvláště těkavější nebo ve vodě rozpustné látky tak mohou z vlasů postupně vymizet. Je třeba počítat i s dalšími externími faktory, např. UV zářením, které mohou uložené látky rozkládat. Zejména nutná je opatrnost při případném odhadu časového horizontu uložení cílové látky. Je proto nutné umět rozpoznat a následně vyhodnotit všechny rušivé faktory mimo vlastní analytické měření, aby jejich vliv mohl být zahrnut do interpretace výsledků.

PČR: Obr. 1 – Schéma ukládání a eliminace drog ve vlasech[1]: Ukládání: 1-krevním oběhem, 2-z přiléhajících tkání, 3-parazitní ukládání z vnějších zdrojů (prach, kouř, ze znečištěných rukou, podporované potem) Eliminace: 4-extrakce z vlasů při mytí (šampony, vlasová kosmetika), 5-rozklad v průběhu barvení/obarvování vlasů a působením UV záření

Drogy ve vlasech

Jak již bylo uvedeno, hlavní podíl na uložení drog ve vlasech má výživa vlasového váčku (folikulu) krevním řečištěm. K vlasovému váčku vedou krevní kapiláry, které váček vyživují. Vlas roste do délky díky neustále se množícím buňkám na dně vlasového váčku. Vlasový váček je uložen v hloubce 3–5 mm pod povrchem kůže.

Vliv přirozené barvy vlasů

Vlasový váček je z důvodu intenzivního dělení buněk velmi dobře zásoben potřebnými látkami krví. Nicméně, v době po užití cizorodé látky se tato látka krevním řečištěm dostává i k vlasové cibulce a část těchto cizorodých látek je zabudována do vlasové struktury. Ve vzdálenosti cca 1–2 mm ode dna vlasového váčku dochází k zabudování pigmentů do vlasového materiálu. Tyto pigmenty mají melaninovou strukturu, odvozenou od aminokyseliny tryptofanu, který je polymerizován. V praxi to znamená, že tyto vlasové pigmenty mají bazický charakter a přednostně se na ni tedy vážou látky bazického charakteru.

Látky bazického charakteru, mezi které rovněž hlavní zneužívané látky (drogy) patří, prochází membránou a na základě koncentračního gradientu se ukládají v melaninu. Jedním z klíčových faktorů množství drogy, která je ve vlasech uložena, je pak množství melaninu, které se ve vlasech nachází. Obecně platí, že tmavé vlasy obsahují mnohem více melaninové složky a tudíž množství bazických látek, uložených ve vlasech je při shodné koncentraci v krvi (krevní plazmě) výrazně vyšší. Literatura udává, že uložení ve vlasech s tmavou pigmentací je až 10krát vyšší, než ve vlasech světlých s nedostatkem melaninové složky[(2,3). Množství uložených drog ve vlasech koresponduje s obsahem melaninové složky. Ve vlasech černých je nejvyšší množství uložených drog, následují vlasy hnědé, světlé a nejnižší množství uložených látek lze vysledovat u vlasů zrzavých.

Vliv lipofility látek a pH krve.

Obecně lze říci, že zabudování drog ve vlasech se řídí základními farmakologickými principy o rozložení drog v těle. Lipofilní, tedy nezměněné drogy lépe prochází membránou a difundují ve shodě s koncentračním gradientem do vlasových buněk v průběhu jejich růstu. Nicméně, pro hydrofilní (tedy metabolizované látky) tvoří membrány nepropustnou bariéru. Zde však může opět hrát roli okamžité fyziologické pH krevní plazmy, které pomáhá protonizaci takovýchto látek a průchod bariérou je pak umožněn na základě změny koncentrace protonizované složky.

Celkové množství zabudovaných látek je pak průnikem obou těchto principů, tedy lipofility a basicity. To vytváří složitou soustavu neznámých faktorů, kolik látky bude nakonec do vlasů zabudováno.

Vliv barvení vlasů a jejich úpravy, vliv UV záření

V průběhu barvení vlasů či jejich další kosmetické úpravy, dochází k používání chemických látek. Zejména odbarvovače jsou založeny na principu použití oxidačních činidel (peroxidů), jejichž úkolem je odstranění melaninu z vlasů. Jak již bylo uvedeno, residua drog jsou vázána především v melaninové složce a tudíž rozrušováním melaninu dochází i ke ztrátám těchto residuí. Dalším faktorem je samotné působení těchto oxidačních činidel na residua těchto látek samotných.

Další možností úpravy vlasů je jejich kadeření za použití chemických činidel, které působí na buňky keratinové (např. kyselina thioglykolová). Ve vlasech dochází k přechodnému rozrušení disulfidických můstků v keratinu a tudíž i porušení vazeb na látky v těchto keratinových buňkách obsažených. Následně jsou tyto látky vyplavovány v průběhu dalších úprav vlasů.

Na vlasy obecně působí vysokoenergetické ultrafialové záření. Působením na residua látek ve vlasech, vystavených tomuto záření, snižuje koncentraci zabudovaných residuí.

Zonální rozložení cizorodých látek

Vlasy rostou trvalou rychlostí asi 0,32 až 0,46 mm za den(4). V průběhu svého růstu, tak jak jsou zásobovány z krevního řečiště, dochází v závislosti na koncentraci cizorodých látek v krvi, k zabudovávání těchto látek, či jejich metabolitů, ve vlasové hmotě. Jednorázové (akutní) užití se však projevuje mnohem méně, než užívání pravidelné (chronické). Po jednorázovém užití sice koncentrace v krevní plazmě rychle narůstá, ale v návaznosti na užitou látku také dochází k jejímu vylučování. Proto se okamžité zabudování do vlasové hmoty projeví jen málo. Naopak, u chronických uživatelů po dobu jejich závislosti dochází k dlouhodobé trvalejší koncentraci drogy či jejích metabolitů v krvi, a proto je zabudování do vlasové hmoty mnohem účinnější. Chroničtí uživatelé pak vykazují v jednotlivých přírůstcích vlasové hmoty mnohem vyšší a tudíž lépe analyzovatelnou koncentraci cizorodých látek(1). Je však překvapující, že korelace mezi dávkou a koncentrací v krvi mezi jednotlivci je obvykle špatná.

Metamfetamin a jeho metabolismus

Uchovávání a stabilita drog ve vlasech je považována za dostatečnou. Hlavní zneužívané látky, které se mohou u chronických uživatelů zjistit, jsou odvislé také od jejich způsobu metabolismu v organismu.

Metamfetamin je druhou nejvíce zneužívanou drogou v České republice. Podle výroční zprávy Národního monitorovacího střediska pro drogy a závislosti (5) bylo v roce 2013 v ČR odhadováno 34.200 problémových uživatelů metamfetaminu. Mezi těmito uživateli převažují osoby s injekčním podáním. Dále je tato látka zneužívána také rekreačními uživateli. Ti nejvíce preferují perorální podání, eventuelně „šňupání“. V roce 2013 bylo Policií ČR odhaleno 261 varen a zajištěno 69 kg hotového produktu. Běžná jednorázová dávka metamfetaminu se pohybuje mezi 10 až 30 mg. Doba poklesu koncentrace v krevní plazmě na polovinu (Half-Time) je udávána 9 hodin.

Po podání dávky metamfetaminu je asi 70 % této dávky vyloučeno močí do 24 hodin (6). Za normálních podmínek je asi 43 % drogy vyloučeno v nezměněné podobě jako metamfetamin. Nad 15 % je vylučováno jako 4-hydroxymetamfetamin a okolo 5 % jako amfetamin. Tyto látky jsou označovány jako hlavní metabolity. Vylučování je též závislé na pH moči, při vyšším pH moči je vylučování intenzivnější. Metamfetamin je dále indikován jako metabolit v případě zneužívání benzfetaminu.

Literatura (7) uvádí, že v případě metamfetaminu v jednom miligramu vlasové hmoty uživatelů je uloženo 0,87 až 56,4 ng, průměrně 18,3 ng a dále 0,12 až 3,5 ng, průměrně 0,96 ng amfetaminu, jako hlavního metabolitu.

Odběr vlasů a jejich skladování

Analýza vlasů na drogy se přednostně provádí v soudních případech. Protože má vážné důsledky, analytik musí převzít vysokou odpovědnost k získání správných výsledků. Proto celý proces od odběru vzorků k výkladu musí být dobře organizován a přesně proveden, aby se zabránilo případným chybám. Například odběry vzorků vlasů a analýzy nejsou povoleny v místech, kde se manipuluje se samotnými drogami. Analytické strategie, které byly vyvinuty, zahrnují prohlídku, konfirmační testování a používání různých metod k získání co nejvíce informací z typicky omezených vzorků.

Význam vlastních kroků před analýzou vlasů je často podceňován. Vzhledem k tomu, že výběr vzorků a volba následných analytických metod vlasů závisí na předpokládaných látkách, měly by být získány všechny relevantní informace a dobře zdokumentovány. Tyto informace obsahují stručný nástin podezření na drogy, datum odběru vzorků, které má být odpovězeno analýzou, a předpokládané využití odborných znalostí. Kromě délky vlasů a barvy je vhodné znát také historii kosmetického ošetření vlasů.

I když v posledních letech byly zavedeny citlivější metody a analytické techniky, praktické provedení odběru vzorků vlasů se v podstatě nezměnilo. Pramen vlasů o průměru 3 až 4 mm je svázán do svazku, např. nití a odstřižen přímo na povrchu kůže. Nejvýhodnější místo na hlavě je týl, protože podíl vlasů v telogenní fázi je nejnižší a rychlost růstu relativně jednotná.

Vzorky vlasů by měly být skladovány v suchých a tmavých podmínkách při pokojové teplotě. Nejjednodušší způsob je v papírových obálkách. Je třeba se vyhnout skladování v plastových sáčcích, neboť může docházet ke kontaminacím změkčovadly plastů a také plast může potenciálně extrahovat lipofilní látky z vlasů. Velmi vhodné je zabalit suchý vzorek vlasů do hliníkové fólie před umístěním v papírové obálce. Za takovýchto podmínek je většina cílových látek a jejich metabolitů velmi stabilní a látky mohou být detekovány i po letech skladování.

Dekontaminace vlasového pramene

Čištění vzorku vlasů od vnější kontaminace je nutné ze dvou důvodů. Za prvé, zbytky kosmetických přípravků pro vlasovou péči (vosk, šampony, laky na vlasy), jakož i potu, kožního mazu a prachu se obvykle projevují v průběhu analýzy a to pak vede ke zvýšenému analytickému šumu pozadí. Za druhé, drogy mohou kontaminovat prostředí, ve kterém se jedinec pohyboval a tak potenciálně přispět k nesprávným výsledkům analýz. Tento typ znečištění prostředí je velmi pravděpodobný pro jednotlivce, kteří manipulují s nelegálními drogami.

Rozpouštědla, použitá při dekontaminaci, by měla odstranit vnější nečistoty pokud možno úplně, avšak nikoliv extrahovat drogy z vlasové matrice (hmoty). Neexistuje žádná obecná metoda, pokud jde o postup mytí vlasů.

Například, jeden mycí postup se skládá z promytí 0,1% dodecylsulfátu sodného ve vodě, následně destilované vody a acetonu. Další postup zahrnují jedno nebo dvě promytí dichlormethanem, či řadu různých organických rozpouštědel, včetně methanolu. Neprotická rozpouštědla, jako je dichlormethan nebo aceton jsou výhodná, protože nemají snahu nabobtnávání vlasů a tím nedochází k extrakci vlastních materiálů z vlasů. Naproti tomu, protická rozpouštědla, jako je fosfátový pufr nebo methanol podporují bobtnání vlasů a tudíž přechod cílových látek do promývacího roztoku. Systematickou studií bylo prokázáno, že analytický výsledek analýzy vlasů může být silně ovlivněn použitým dekontaminačním postupem (8).

Extrakce vlasové hmoty

Doposud neexistují metody pro přímou detekci drog ve vlasech jako takových. Proto zájmové analyty musí být extrahovány samotným rozpuštěním nebo štěpením vlasů. Ke zvolení vhodného postupu extrakce je nutno zvážit chemickou strukturu analytu a jeho citlivost na použitá extrakční činidla. Před extrakcí je nezbytné vlasy rozdělit na částice obvykle 1 až 3 mm. Vlasy mohou být také zpracovány mletím, ale tato metoda má obecně za následek ztrátu materiálu vzorku a nemusí zlepšit proces extrakce.

Extrakce methanolem

Extrakce methanolem je vhodná pro široké spektrum analytů. Provádí se za použití ultrazvukové lázně po dobu 5 až 18 hodin. Hydrofilní methanol proniká do vlasové hmoty a rozpouští látky z vlasové hmoty difusním procesem. Methanol rozpouští neutrální a lipofilní sloučeniny. Ultrazvuk způsobuje silnou degradaci struktury vlasů a podporuje tento proces. Nevýhodou tohoto postupu je však vysoká hladina nečistot v extraktu. Proto se obecně doporučuje následné čištění (clean-up), zahrnující extrakci kapaliny kapalinou nebo extrakci na pevné fázi (SPE). I přes delší extrakční dobu v ultrazvukové lázni, výtěžek extrakce je neúplný a často nižší ve srovnání s jinými postupy.

Rozklad vlasů pomocí roztoku hydroxidu a extrakce metamfetaminu

U látek, které jsou stabilní v alkalickém prostředí, je vhodnou metoda extrakce vlasů digesce 1M roztokem hydroxidu sodného po dobu jedné hodiny při teplotě 80 °C. Tento způsob extrakce je použitelný zejména pro amfetaminy. Obecně platí, že lze předpokládat kvantitativní extrakci analytů z vlasové matrice. Před vlastní extrakcí je nezbytné vlasy rozdělit na co nejmenší částice. Typické je nastříhání na 1–2 mm velké části např. pomocí ostrých nůžek.

Vyjma extraktů v methanolu, analýzy přímým nástřikem do GC-MS nejsou možné z důvodu nečistot přítomných ve vodných extraktech, či extraktech po rozkladu vlasové hmoty jinými činidly. Nutné je před vlastní analýzou získané extrakty z vlasové hmoty přečistit.

Metody používané k tomuto účelu jsou podobné těm, které se používají při izolaci drog z plazmy nebo moči. Jsou popsány možné způsoby přečištění extrakčními postupy pro kapalinu-kapalinou. Dále je možná též extrakce na pevné fázi (SPE).

Pro kombinované analýzy plynovou chromatografií s hmotnostní spektrometrií (GC-MS) je rovněž výhodné použití metody mikroextrakce na pevné fázi (SPME) (9). Těkavé látky, zejména amfetaminy mohou být extrahovány přímo z plynné fáze vlákny SPME po rozkladu pomocí NaOH. Přítomnost amfetaminů byla stanovena z méně než 1 mg vlasů. V závislosti na předpokládaném analytu (lipofilita a těkavost), mohou být použita vlákna s různým pokrytím. Při vyšší teplotě může tato metoda využívat také principu destilace s vodní parou. Výhodou této metody je to, že může být provedena bez organických rozpouštědel. Kromě toho se vlákno vhodně regeneruje při desorpci vzorku ve vstřiku (injektoru) GC.

Provedení analýzy

Instrumentální metody používané v analýze vlasů, musí být vhodné pro jednoznačnou identifikaci drog a kvantifikaci. Je však obtížné vyvinout obecné screeningové metody pro residua látek ve vlasech, vzhledem k nízkým koncentracím těchto látek a malému množství vzorku.

Tandemová metoda kapilární plynová chromatografie – hmotnostní spektrometrie je nejčastěji používanou metodou při analýze vlasů. K výhodám GCMS patří vysoká separační schopnost kapilární GC a vysoká specifičnost hmotnostního spektra. Metody jsou rozšířeny pomocí měření ve zvoleném režimu monitorování iontů (SIM) a použití deuterovaných vnitřních standardů (isotopomerů). Společně tyto metody umožňují rozvoj specifických a citlivých postupů pro širokou škálu analytů, s dostatečnou přesností při velmi nízké koncentraci. Mez detekce (LOD) pro GC-MS je asi 0,03 ng/mg pro většinu drog.

Předpokladem pro provádění GC-MS je, že látka je dostatečně těkavá a stabilní při vysoké teplotě. Tyto vlastnosti však nemusí splňovat drogy s volnými amino- a hydroxy- skupinami.

Zvýšení citlivosti s LOD mezi 0,2 a 15 pg/mg vlasů bylo pro mnoho sloučenin zaznamenáno při použití pozitivní nebo negativní chemické ionizace (10). Nevýhodou tohoto postupu je však ztráta specifičnosti identifikace látky z důvodu fragmentace těchto spekter. Zvýšení citlivosti a identifikace specifické látky se v poslední době zlepšuje při používání MS/MS a HRMS technik (11).

Blank vlasy

K udržení správných a validních výsledků je nezbytné pracovat s vlasy, které neobsahují žádné analyty, jež by mohly poskytnout nesprávné výsledky – tzv. slepé vlasy, blank vlasy.

Získání takových vlasů je však velmi problematické. Je možné použít vlasy od dětí a tyto vlasy jsou forenzními pracovišti také pro tento účel využívány. Druhou možností je pak zakoupení standardů blank vlasů, což však představuje značné finanční náklady.

K ověření metod jsou dále využívány specifické vlasy se stanoveným obsahem cílových analytů, které jsou některými firmami dodávány. Také tyto standardní vlasy představují nemalé finanční náklady. Jsou využívány především v okružních testech mezilaboratorního srovnání.

Experimentální část

Vlasy bez residuí (blank) byly získány od osoby ženského pohlaví věku 8 let, světlých vlasů. Tyto vlasy byly po promytí vodou, vysušení, následným trojnásobným promytím dichlomethanem a methanolem opět vysušeny, nastříhány ostrými nůžkami na asi 1mm částice. Tyto nastříhané vlasy byly po celou dobu experimentů uchovávány ve skleněné zabroušené prachovnici v temnu.

Vlasy s obsahem stanovených cílových analytů byly získány nákupem od firmy LGC Standards. Vlasy od uživatelů byly získány přes nízkoprahová centra drogově závislých v Praze a Olomouci.

Potřebné standardy drog (metamfetamin, amfetamin) a jejich isotopomer (metamfetamin-d5) byly zakoupeny od firmy Lipomed.

Organická rozpouštědla (methanol, dichlormethan) byly zakoupeny od firmy Merck v čistotě Suprasolv ®.

Kyselina chlorovodíková a hydroxid sodný byly zakoupeny od firmy Lach-Ner v čistotě p.a. K rozpouštění těchto látek a dalším operacím ve vodném prostředí byla používána voda ze zařízení Watrex Ultrapur v čistotě UHPLC.

Pro mikroextrakci na pevnou fázi (SPME) byla použita vlákna firmy Supelco.

Odpařování vzorků a jejich zahušťování k analýzám bylo prováděno na zařízení Termovap TV 10 proudem suchého dusíku, čistoty 4N.

Měření bylo prováděno s využitím instrumentace Agilent GC 6890S v kombinaci s MSD Agilent 5975N. Podmínky separace: kolona DB-5ms J&W 122–5532, délka 30 m, vnitřní průměr 0,250 mm, pokrytí 0,25 μm. Nástřik splitless, teplota nástřiku 240 °C, teplota kolonové pece 55 °C/1 minuta, poté 9 °C/min na teplotu 175 °C, 175 °C držet 5 minut. Průtok kolonou 1,4 ml/min, nosný plyn helium, výstup vakuum, teplota transfer-line 285 °C. Podmínky MS: Ionizace EI, teplota zdroje 230 °C. Sběr dat v podmínkách SIM s následujícími vybranými ionty: 44, 58, 62, 65, 91, 92, 120 a 139 Da.

Výsledky a diskuse

K pokusům se spikovanými vlasy byly používány blank vlasy, připravené dle předchozí kapitoly. Ke spikování byl použit metamfetamin. K vlasům blank byl přidán analyt ve známém množství a následně byly prováděny experimenty, zaměřené na získání tohoto analytu ve známém množství (recovery).

K analýze metamfetaminu ve spikovaných vlasech byla použita metoda SPME a MS-MS na přístroji Varian. K blank vlasům v množství 250 mg ve šroubovací vialce 4 ml byl přidán metamfetamin v množství 250 ng ve vodném roztoku. Poté bylo do vialky přidáno 2 ml 0.5M roztoku hydroxidu sodného ve vodě a vialka byla uzavřena víčkem s propichovacím septem. Následně byla vialka zahřívána po dobu 1 hodiny při 80 °C ve vyhřívacím bloku. Poté bylo pomocí kondiciovaného vlákna SPME odebírána při 80 °C po dobu 20 minut plynná fáze nad kapalinou.

Následně získaný chromatogram byl vyhodnocen na plochu iontu 91. Pokus byl opakován 10x a byla použita následující vlákna: Carboxen/PDMS black 75 μm a Divinylbenzene/Carboxen/PDMS (Triple-Phase) gray 50/30 μm. Vlákno Carboxen se příliš neosvědčilo, zejména z důvodu jeho poškozování při opakovaných nástřicích. Vlákno Triple-Phase vykazovalo mnohem vyšší stabilitu, nicméně výsledky získané tímto vláknem vykazovaly také značné statistické odchylky v průběhu jednotlivých analýz, které se nepodařilo náležitě vysvětlit. Jedním z důvodů může být parazitní sycení vlákna dalšími látkami, které sice nebyly sledovány, nicméně mohly konkurovat sorpci na vlákně a tak snižovat sorpci vlastního analytu metamfetaminu. Eventuelně tyto sorbované látky „zhášejí“ ionizaci v iontovém zdroji MS. Výsledky dokumentuje následující graf:

PČR: Graf č. 1. – Plocha píku 91 pro opakovaná měření, vlákno Triple-Phase

RSD celé série je více než 66 %. Reprodukovatelnost je tudíž velmi nízká a recovery metamfetaminu z alkalického rozkladu vlasů lze hodnotit jako naprosto nevyhovující.

Následně po zakoupení isotopomeru metamfetaminu-d5 byly pokusy opakovány s tím, že k blank vlasům bylo přidáváno stejné množství metamfetaminu (250 ng) a stejné množství metamfetaminu-d5. Ani zde se nepodařilo vysledovat závislost, která by umožňovala exaktní stanovení recovery. Co však z těchto experimentů vyplynulo, bylo získání závislosti sorpce metamfetaminu ve srovnání s jeho isotopomerem. Z provedených experimentů vyplynulo, že množství sorbovaného metamfetaminu je vždy srovnatelné s jeho isotopomerem. V praxi se tím podařilo vytvořit alespoň srovnávací metodu, kdy porovnáním plochy 91 pro metamfetamin s plochou 92 pro isotopomer lze konstatovat, že pokud jsou plochy těchto dvou iontů srovnatelné, lze hovořit o přítomnosti metamfetaminu ve zkoumaných vlasech.

PČR: Graf č. 2. – Porovnání ploch píku 91 a 92 pro opakovaná měření, vlákno Triple-Phase

V případě používání SPME metody pro odběr metamfetaminu, se úspěšně podařilo využití instrumentace s jednoduchým kvadrupólem na přístroji Agilent. To umožnilo vytvoření rozhodovací metody pro analýzu vlasů s výsledkem pozitivní/negativní nález, založené na porovnání ploch metamfetaminu s jeho isotopomerem. Navíc přístroj Agilent umožňuje uzamčení retenčního času (RT Lock), což rovněž přispívá k validitě metody identifikace metamfetaminu ve vlasech. Lze tedy sledovat nejen ionty, ale také jejich retenční čas.

Výsledky umožnily vypracování certifikované metody, použitelné pro kvalitativní analýzu zjištění přítomnosti metamfetaminu ve vlasech suspektní osoby. Metodika je použitelná pro operativní účely.