Stanovení 5-hydroxymethylfurfuralu a vybraných sacharidů v medovinách

Tato práce je zaměřena na stanovení 5-hydroxymethylfurfuralu (HMF), glukosy, fruktosy a sacharosy v medovinách. Pro stanovení HMF byla použita vysokoúčinná kapalinová chromatografie v systémech s obrácenými fázemi se spektrofotometrickou detekcí. Sacharidy byly separovány s využitím chromatografie hydrofilních interakcí s refraktometrickou detekcí. Pomocí výše zmíněných separačních technik byl stanoven obsah HMF a sacharidů ve 23 vzorcích medovin získaných od různých výrobců. Jejich obsah se lišil v závislosti na technologickém postupu výroby medoviny a mohl by být použit jako ukazatel kvality medovin. Obsah HMF byl nižší u vzorků medovin získaných od včelařů než u vzorků medovin získaných v místní obchodní síti.

1 ÚVOD

Medovina je alkoholický nápoj vyráběný kvašením vodného roztoku medu s využitím kulturních vinných kvasinek. Do směsi medu a vody lze přidat koření, byliny, ovocné šťávy nebo chmel (Švecová et al., 2015). Obsah přirozeně vzniklého alkoholu se pohybuje okolo 15 %. V současné době se pro výrobu medoviny využívají dva technologické postupy, které se liší úpravou vodného roztoku medu před kvašením. U vařených medovin se používá převařený vodný roztok medu, kdy během varu dochází k usmrcení nežádoucích mikroorganismů a zároveň k vysrážení bílkovin do podoby pěny, která je následně odstraněna (Kahoun et al., 2017). Nevařené medoviny se připravují pouhým smícháním vodného roztoku medu s kvasinkami a následným kontrolovaným kvašením. Pro tento způsob výroby jsou používány vysoce kvalitní druhy medů, jejichž chuť a vůně není znehodnocena vařením (Cibulka, 2003).

Vzhledem k nedostatečnému legislativnímu ošetření kvality medovin, se na trhu vyskytují výrobci, kteří při výrobě medoviny používají menší množství medu, než je dáno vyhláškou Ministerstva zemědělství č. 335/1997 Sb. (min. 280 g medu na 1 litr medoviny) nebo používají medy nekvalitní a spotřebitel tak za poměrně vysokou cenu nedostane požadovanou kvalitu. Cílem této práce je proto najít ukazatele jakosti medovin, které nekvalitní medoviny odhalí. Mezi tyto ukazatele by mohly patřit 5-hydroxymethylfurfural (HMF) a sacharidy (glukosa, fruktosa, sacharosa).

HMF a jeho deriváty (5-chlormethylfurfural a 5-sulfoxymethylfurfural) jsou cyklické aldehydy, vyskytující se v potravinách obsahujících sacharidy (Kalábová et al., 2003; Makawi et al., 2009; Spano et al., 2006). Mají cytotoxické, genotoxické a mutagenní účinky a jsou podezřelé z karcinogenity. Mohou způsobovat podráždění očí, horních cest dýchacích, kůže a sliznic. V čerstvých potravinách se HMF téměř nevyskytuje. Velký vliv na jeho obsah má teplota a doba zahřívání, podmínky skladování, typ sacharidů a aminokyselin, pH, aktivita vody a koncentrace kovových iontů (Kahoun et al., 2017; Khalil et al., 2010; Pereira et al., 2011).

V medu vzniká HMF v malém množství již během zrání v plástech. Jeho koncentrace závisí, kromě již zmíněných parametrů, jako je teplota a pH, také na stáří medu, botanickém původu, vlhkosti a termálním a fotochemickém stresu. Z toho důvodu je významným parametrem pro určování čerstvosti a kvality medu (Kahoun et al., 2017; Kalábová et al., 2003; Makawi et al., 2009; Spano et al., 2006; Švecová et al., 2015) a mohl by sloužit i k ověření kvality medoviny.

Pro stanovení HMF v čistém, filtrovaném, vodném roztoku medu se nejčastěji využívají separační techniky v kapalné fázi, jako vysokoúčinná kapalinové chromatografie v systémech s obrácenými fázemi (RP-HPLC) (Coco et al., 1996; Costa et al., 1999; Kahoun et al., 2008; Kahoun et al., 2017; Makawi et al., 2009; Spano et al., 2006; Švecová et al., 2015; ) nebo kapilární elektroforéza (Wong et al., 2012). K detekci se zpravidla používá spektrofotometrického detektoru. Vlnová délka, při níž se měří, je dána absorpčním maximem HMF, které je při 285 nm. Jako mobilní fáze se používají vodné roztoky methanolu nebo acetonitrilu.

V medu a potažmo v medovinách je obsaženo vysoké množství sacharidů, především monosacharidů glukosy a fruktosy, které určují většinu fyzikálních a nutričních vlastností těchto produktů. Pro separaci těchto sacharidů se nejčastěji využívá chromatografie hydrofilních interakcí (Mendes et al., 1998; Švecová et al., 2015). Z důvodu absence chromoforu se k detekci používá refraktometrického detektoru či detektoru rozptylu světla. Hmotnostní spektrometr, spektrofotometrický nebo fluorescenční detektor se pro detekci sacharidů využívají zpravidla po předchozí derivatizaci (Harvey, 2011; Lamari et al., 2003). Další možností je stanovení sacharidů s využitím plynového chromatografu nebo pomocí iontové chromatografie, gelové chromatografie či kapilární elektroforézy (Ouchemoukh et al., 2010; Slimestad a Vågen, 2006; Wang a Fang, 2004).

2 MATERIÁL A METODY

2.1 Vzorky medovin

Celkem bylo analyzováno 23 vzorků medovin, které byly poskytnuty včelaři z různých oblastí ČR (vzorky 1-12) nebo zakoupeny v místní obchodní síti (vzorky 13-23). Medoviny byly uchovávány v lednici (4 °C) a otevřeny před analýzou. Vzorky byly před analýzou ředěny vodou (HMF) nebo 50% acetonitrilem (sacharidy) a filtrovány pomocí stříkačkového filtru (nylon, 0.45 μm, 13 mm), Labicom, Olomouc, ČR.

2.2 Chemikálie a roztoky

D(+)-glukosa monohydrát, D(-)-fruktosa a sacharosa v čistotě pro biochemii byly zakoupeny u firmy Merck (Darmstadt, Německo). 5-hydroxymethylfurfural (99%) dodala firma Fluka (Buchs, Švýcarsko). Jako organická složka mobilní fáze byla použita rozpouštědla methanol a acetonitril v čistotě pro gradientovou eluci (Merck). Deionizovaná voda byla upravena čisticím zařízením Milli-Q (Millipore, Billerica, Massachusetts, USA).

Standardní roztok HMF (c = 200 mg.l⁻¹) byl připraven rozpuštěním HMF ve vodě. Z tohoto standardního roztoku bylo připraveno osm kalibračních roztoků v rozsahu koncentrací 0,3 – 15 mg.l⁻¹. Kalibrační roztoky sacharidů (na osmi koncentračních hladinách) byly připraveny ze standardních roztoků glukosy a fruktosy (c = 60 g.l⁻¹) v rozsahu koncentrací 1,2–42 g·l⁻¹ a sacharosy (c = 30 g·l⁻¹) v koncentračním rozsahu 0,3–30 g.l⁻¹. Pro přípravu zásobních i kalibračních roztoků byl použit 50% acetonitril. Připravené standardy a vzorky byly filtrovány přes membránový filtr (nylon, 0,45 μm, 13 mm, Labicom, Olomouc, ČR).

2.3 Stanovení HMF v medovinách

Pro stanovení HMF v medovinách byl použit kapalinový chromatograf HP 1090 LC vybavený DAD detektorem, termostatem kolon a autosamplerem (Hewlett Packard, Palo Alto, California, USA). Pro separaci byla použita kolona Supelcosil LC-18-T; (150 x 4,6 mm, 5μm částice) s odpovídající předkolonkou (Supelco, Bellefonte, Pennsylvania, USA). Průtok mobilní fáze o složení methanol: voda (15:85, v/v) byl 0,6 ml.min⁻¹, dávkovaný objem vzorků 20 μl, teplota 25 °C a vlnová délka 285 nm. Vzorky byly proměřeny čtyřikrát.

2.4 Stanovení glukosy, fruktosy a sacharosy v medovinách

Pro stanovení sacharidů byl použit kapalinový chromatograf sestavený z čerpadla mobilní fáze LC-20AD, termostatu CTO-20AC, diferenciálního refraktometrického detektoru RID-10A (vše Shimadzu, Kyoto, Japonsko) a šesticestného dávkovacího ventilu (Ecom, Praha, ČR). Optimalizace separace byla provedena s využitím kolony Supelcosil LC-NH2 (250 x 4,6 mm, 5 μm částice) a Supelcosil LC-NH2 (150 x 3 mm, 3 μm částice), obě Supelco, a kolony LUNA NH2 100A (150 x 3 mm, 3 μm částice), Phenomenex, Torrance, California, USA. Finální separace probíhala za izokratických podmínek na koloně Supelcosil LC-NH2 (250 x 4,6 mm, 5 μm částice) s mobilní fází acetonitril:voda (80:20, v/v). Průtok mobilní fáze byl 2 ml.min⁻¹, dávkované množství 20μl a teplota kolony 25 °C. Vzorky byly proměřeny čtyřikrát.

2.5 Statistické vyhodnocení experimentálních dat

Kalibrační závislosti byly pro kvantifikaci HMF, glukosy, fruktosy a sacharosy měřeny na osmi koncentračních hladinách s počtem opakování n = 4. Regresní parametry kalibračních závislostí byly vyhodnoceny statistickým programem QC Expert 2.9 (TriloByte, ČR). Ve všech případech byla experimentální data proložena lineární regresí s využitím metody nejmenších čtverců. Testování probíhalo na hladině významnosti 95% (α = 0,05). Pomocí Pregibonova, Williamsova, L-R a McCulloh-Meterova grafu byly identifikovány vlivné body a po jejich odstranění byly určeny regresní parametry spolu s jejich směrodatnými odchylkami a koeficienty determinace (tab. 1). Dále byla testována významnost absolutního členu. V případě sacharidů byl absolutní člen nevýznamný a přímka prochází nulou. Mez detekce (LOD) a mez stanovitelnosti (LOQ) byl vyhodnocen jako trojnásobek a desetinásobek odstupu signálu od šumu (tab. 1). Pro určení LOD a LOQ byla využita kalibrační data. Přesnost a správnost byla testována proměřením dvou kalibračních roztoků desetkrát. Pro tento účel byly vybrány kalibrační roztoky odpovídající koncentraci v polovině kalibrační křivky a na hladině 80% z LOQ. Relativní směrodatná odchylka (RSD) nepřekročila 5%. Opakovatelnost byla ověřena měřením vybraného vzorku celkem 15 krát. RSD byla pod 3%.

Tab. 1 Regresní parametry kalibračních závislostí, koeficient determinace, mez detekce a stanovitelnosti pro jednotlivé studované látky.

3 VÝSLEDKY A DISKUZE

3.1 Optimalizace podmínek a stanovení HMF v medovinách

Proměřením standardů a reálných vzorků medovin byly optimalizovány podmínky separace HMF v systémech s obrácenými fázemi za izokratických podmínek s využitím methanolu (10, 15 a 20%, v/v) nebo acetonitrilu (15%, v/v) jako organického modifikátoru. Dále byl testován různý průtok mobilní fáze (0,6 – 0,8 ml.min-1) a vliv přídavku kyseliny octové (1%, v/v) do mobilní fáze. Optimální separace a oddělení HMF od ostatních polárních látek obsažených v medovinách bylo dosaženo při průtoku 0,6 ml.min-1 s mobilní fází 15% methanolu. Retenční čas HMF za těchto podmínek byl 6,4 min. Finální separace dvou vzorků medoviny lišící se koncentrací HMF je uveden na obr. 1.

Obr. 1 Chromatografická separace HMF ve vzorku medoviny 7 (plná čára) a vzorku medoviny 20 (přerušovaná čára)

Pro obsah HMF v medovinách prozatím neexistují normy, avšak ve vyhlášce Ministerstva zemědělství č. 335/1997 Sb. je uvedeno, že na výrobu medoviny se musí použít minimálně 280 kg medu na 1000 litrů medoviny. Jestliže národní legislativa ustanovuje maximální množství HMF na 40 mg.kg-1 medu (vyhláška Ministerstva zemědělství č. 76/2003 Sb.), měl by se obsah HMF při použití minimálního množství medu v medovině pohybovat přibližně do 12 mg.l⁻¹ medoviny. U kvalitních medovin je pro výrobu 1 litru použito až 0,5 kg medu, čímž vzrůstá obsah HMF. Další nárůst může být způsoben konečnou úpravou senzorických vlastností produktu (doslazení a dobarvení). Při zohlednění těchto skutečností by mohl být maximální obsah HMF v medovinách až 30 mg.l⁻¹.

Vzhledem k tomu, že HMF vzniká při tepelné úpravě potravin obsahujících cukry, předpokládá se rozdíl v obsahu HMF u medovin připravených různými technologickými postupy. Koncentrace HMF u studovaných vzorků medovin spolu s intervaly spolehlivosti je uvedena na obr. 2. Hranice 30 mg.l⁻¹ HMF nebyla překročena u žádného ze vzorků poskytnutých včelaři (vzorky 1–12), kteří medoviny připravují nevařeným způsobem. V případě tzv. medových vín (vzorky 4–8), kde u konečného produktu nedochází k úpravě chuti přislazením (karamel nebo med), případně k úpravě barvy, byla koncentrace HMF pod 10 mg.l⁻¹, u vzorku č. 6 byla koncentrace HMF pod mezí detekce. U medovin získaných v místní obchodní síti (vzorky 13–23), kde není znám technologický postup výroby, je pozorován větší rozdíl v obsahu HMF. U vzorků medovin 13,14 a 20 byla koncentrace HMF nad hranicí 30 mg.l⁻¹, u vzorků 13 a 14 bylo zjištěno větší množství HMF (nad 65 mg.l⁻¹), což může být způsobeno odlišným technologickým postupem nebo použitím méně kvalitního medu. Ostatní vzorky medovin zakoupených v místní obchodní síti měly koncentraci HMF v rozmezí 16,3–25,7 mg.l⁻¹. U vzorků 15 a 19 byla dokonce zaznamenána koncentrace HMF pod 10 mg.l⁻¹. U těchto dvou vzorků je na etiketě uveden způsob výroby medoviny za studena. Koncentrace HMF u námi studovaných vzorků jsou však stále mnohonásobně nižší než prezentovala Švecová et al. (2015), kde nejnižší pozorovaná koncentrace byla 27 mg.l⁻¹, zatímco nejvyšší koncentrace až 200 mg.l⁻¹. Široká škála vzorků medovin byla rovněž testována ve studii Kahoun et al. (2008), kde koncentrace HMF byla pod 30 mg.l⁻¹ u 60% z testovaných vzorků a 10% vzorků bylo těsně nad touto hranicí. Zbylých 30% vzorků se pohybovalo v rozmezí koncentrací 40-158 mg.l⁻¹. Vyšších koncentrací HMF bylo pozorováno vždy u stejného výrobce, z čehož lze usuzovat, že použitá technologie při výrobě medoviny ovlivňuje obsah HMF. Zahřívání medu nezpůsobuje tak velký nárůst koncentrace, pokud med v průběhu přípravy medoviny není vařen při 100 °C (Kahoun et al., 2017). V takovém případě může být nárůst obsahu HMF až 93 %. Dalším faktorem může být skladování medoviny. Během skladování medovin při pokojové teplotě může obsah HMF také rychle stoupat (Kahoun et al., 2017).

Obr. 2 Koncentrace HMF stanovená v analyzovaných vzorcích medovin. Vzorky 1-12 byly poskytnuty včelaři, vzorky 13-23 byly zakoupeny v místní obchodní síti. Hodnoty jsou uvedeny s intervalem spolehlivosti na hladině významnosti 95%.

3.2 Optimalizace separace a stanovení glukosy, fruktosy a sacharózy

Optimalizace separace sacharidů byla provedena na třech různě dlouhých kolonách s chemicky vázanou aminopropylovou stacionární fází dodaných různými výrobci. Dostatečné rozlišení separovaných sacharidů bylo dosaženo na koloně Supelcosil LC-NH2 (250 x 4,6 mm, 5μm částice). Optimalizována byla rovněž koncentrace acetonitrilu ve vodě (75, 80 a 85 %, v/v), průtok mobilní fáze (1, 2, 3 ml. min⁻¹) a teplota kolony (25, 30, 35 a 40 °C). Všechny experimenty byly provedeny za použití izokratických podmínek, což je nezbytné v případě využití refraktometrického detektoru. Optimálních podmínek separace, s rozlišením všech separovaných látek větším než 1,5, bylo dosaženo při použití mobilní fáze 80% acetonitrilu ve vodě při průtoku 2 ml.min⁻¹ a teplotě kolony 25 °C. Retenční časy fruktosy, glukosy a sacharosy za uvedených podmínek byly 3,9 min, 4,6 min a 5,6 min (obr. 3).

Obr. 3 Chromatografická separace standardů sacharidů

Koncentrace sacharidů v medovině se nedají porovnávat s legislativou pro med, protože při kvašení dochází k odbourávání sacharidů za vzniku oxidu uhličitého a ethanolu. Konečný výrobek nemusí být dochucen nebo může být doslazen medem, sacharosou případně invertním cukrem, kterým může být upravena také barva medoviny.

Koncentrace studovaných sacharidů v jednotlivých vzorcích medovin je uvedena na obr. 4. Jedinou medovinou doslazovanou řepným cukrem (koncentrace 52,6 g.l⁻¹) byla medovina číslo 15. Tato medovina měla pak i nižší koncentrace fruktosy (15,0 g.l⁻¹) a glukosy (15,4 g.l⁻¹). Ostatní medoviny měly koncentraci sacharosy pod mezí detekce. U vzorků medoviny 4–7 byl patrný velmi nízký obsah sacharidů (fruktosa 3,2–12,6 g.l⁻¹ a glukosa 1,3–5,1 g.l⁻¹). Jde o medoviny připravované za studena bez dodatečného doslazení finálního produktu, tzv. medová vína. U ostatních vzorků je obsah glukosy a fruktosy mnohonásobně vyšší (fruktosa 30,4-101,5 g.l⁻¹ a glukosa 11,6–88,3 g.l⁻¹), což je v souladu s prací Švecová et al. (2015). Poměr obsahu těchto cukrů není u každého vzorku stejný, což je způsobeno typem medu, který byl pro výrobu medoviny použit a rovněž hraje roli postup výroby medoviny a dodatečné dochucení.

Obr. 4 Koncentrace sacharidů stanovená ve studovaných vzorcích medovin. Vzorky 1–12 byly poskytnuty včelaři, vzorky 13–23 byly zakoupeny v místní obchodní síti. Hodnoty jsou uvedeny s intervalem spolehlivosti na hladině významnosti 95%

4 ZÁVĚR

Práce byla zaměřena na stanovení 5-hydroxymethylfurfuralu, fruktosy, glukosy a sacharosy ve vzorcích medovin získaných od různých výrobců z České Republiky a Slovenska. Vzhledem k tomu, že na výrobu 1 litru medoviny se musí použít 280–500 g medu, obsah HMF u medovin vyrobených tzv. za studena bez doslazení a dobarvení by neměl být vyšší než 30 mg.l⁻¹. Tuto hodnotu překročily v rámci naší studie tři vzorky medovin, které byly zakoupeny v místní obchodní síti. U těchto vzorků není znám technologický postup jejich výroby, ale vzhledem k vysokému obsahu HMF se dá usuzovat na značné zahřátí výchozí suroviny, či na dodatečnou finální úpravu produktu. Obsah sacharidů dává informaci o typu medu použitého k výrobě medoviny a o jejím konečném dochucení. Pokud jsou medoviny doslazovány, dobarvovány medem či karamelem, dochází ke zvýšení obsahu sacharidů, ale také HMF. V této studii bylo odhaleno dochucení medoviny sacharózou, což je sacharid běžně se v medu nevyskytující v tak vysoké koncentraci. Obsah studovaných látek spolu s dalšími vybranými parametry by mohl sloužit ke kontrole kvality medoviny a ochraně spotřebitele.