Stanovení obsahu šťavelové kyseliny v ječmeni a sladu pomocí RP-HPLC

Šťavelová kyselina je obsažena jako přirozená složka v pivovarských surovinách. Její největší část je vázána ve formě rozpustných sodných a draselných solí, zatímco s vápenatými ionty tvoří nerozpustný šťavelan vápenatý. Šťavelová kyselina přítomná v pivu může i v nízké koncentraci způsobit, zvláště ve formě šťavelanu vápenatého, přepěňování piva (gushing). Byl sledován obsah šťavelanů v pěti odrůdách ječmene (Jersey, Prestige, Malz, Sebastian a Kompakt) a z nich vyrobených sladech ze sklizně 2007. Dále byl sledován vliv cílené kontaminace obilek ječmene mikromycetami rodu Fusarium a následného použití fungicidu. Byla optimalizována metoda stanovení kyseliny šťavelové pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s UV detekcí. Validační parametry byly následující: LOD 1,0 mg.kg⁻¹ , LOQ 3,7 mg.kg⁻¹, R2 0,9990, RSD 0,7 %, výtěžnost 80 až 85 %.

1 ÚVOD

Šťavelová (ethandiová) kyselina tvoří přirozenou složku potravin rostlinného původu. Ve vysokých koncentracích ji obsahuje zejména šťovík, rebarbora, špenát a červená řepa, v menší míře i luštěniny, ořechy (1, 2) a obiloviny (1). Je rovněž známo, že některé patogenní houby (Sclerotinia) ji mohou produkovat jako součást procesu invaze do rostlinných tkání (3).

Hladina šťavelové kyseliny kolísá v závislosti na rostlinném druhu, odrůdě a způsobu pěstování. Největší část je vázána ve formě rozpustných sodných a draselných solí; s vápenatými ionty tvoří nerozpustný šťavelan vápenatý, který se může u lidí i zvířat hromadit v ledvinách a tvořit tam krystaly. Vazbou vápenatých iontů šťavelová kyselina zároveň blokuje metabolismus vápníku v organismu.

Šťavelová kyselina je rovněž obsažena jako přirozená složka v ječmeni a sladu. Její nadměrné množství však může vést k tvorbě krystalizačních jader, což může mít za následek přepěňování piva – gushing (4, 5).

Šťavelová kyselina tedy hraje negativní roli jak z hlediska fyziologie výživy, tak i v pivovarské technologii. Obsah šťavelové kyseliny v pivu se pohybuje v rozmezí 4 až 32 mg.l⁻¹. I když se nejedná o vysokou koncentraci, může způsobit, zvláště ve formě šťavelanu vápenatého, známou formu tzv. „oxalátového zákalu“ a již zmíněný gushing.

Obsah šťavelanů v pivu je určen převážně obsahem šťavelanů v ječmeni a ve sladu. Je ovlivněn nejen ročníkem, ale i odrůdou. Ovlivnit množství šťavelanů může i obsah vápníku v pivovarské vodě. Sledováním obsahu šťavelanů v pivovarských surovinách se získávají nezbytné potřebné informace o jejich případném podílu na procesech souvisejících s přepěňováním (6).

2 MATERIÁL A METODY

Chemikálie

Dihydrogenfosforečnan draselný p. a. (Lach-Ner), methansulfonová kyselina (Fluka), kyselina sírová (Lach-Ner), šťavelová kyselina (Fluka), deionizovaná voda.

Ječmen

Pro analýzy byly vybrány vzorky pěti odrůd ječmene – Jersey, Prestige, Malz, Sebastian a Kompakt, pěstované po předplodině kukuřici. Vzorky pocházely ze sklizně 2007. Vzorky byly rozděleny do tří skupin podle typu ošetření: vzorky cíleně infikované sporami rodu Fusarium, vzorky cíleně infikované a následně ošetřené fungicidem a vzorky neinfikované a neošetřené.

Slad

Ze vzorků ječmene uvedených v předchozí kapitole byly připraveny slady. Ke sladování byla použita technologie vyvinutá ve Sladařském ústavu v Brně (7).

Sladina

Vzorky kongresní sladiny byly připraveny standardní technologií dle metodiky EBC (8).

Příprava a zpracování vzorků ječmene a sladu

1 g ječmene nebo sladu pro analýzu šťavelanů rozpustných ve vodě byl pomlet na laboratorním mlýnku, rozmíchán v 50 ml destilované vody a povařen ve vodní lázni o teplotě 95 °C po dobu 30 minut. Po ochlazení na laboratorní teplotu byl extrakt kvantitativně převeden do odměrné baňky a doplněn destilovanou vodou na 100 ml. Po důkladném promíchání a po usazení pevných částic byl extrakt zfiltrován přes membránový filtr a filtrát byl použit pro analýzu. Paralelně byla provedena stejným způsobem extrakce totožných vzorků v 50 ml 1 mol.l⁻¹ kyseliny sírové pro rozlišení šťavelanu vápenatého od vodorozpustných šťavelanů. Ve vzorcích ječmene a sladu byl stanoven obsah vody sušením do konstantní hmotnosti a obsahy šťavelanů byly potom přepočteny na obsah v sušině.

Vzorky sladiny pro analýzu vodorozpustných šťavelanů byly před nástřikem pouze zfiltrovány a zředěny.

Příprava standardů šťavelové kyseliny

Zásobní roztok standardu šťavelové kyseliny byl připraven navážením 500 mg šťavelové kyseliny s přesností na 0,1 mg a rozpuštěním v 1 litru mobilní fáze (viz níže). Rozsah koncentrací standardu pro vlastní stanovení byl 5 až 50 mg.l⁻¹.

Instrumentace a chromatografické stanovení

Analýzy vzorků byly prováděny na kapalinovém chromatografu Spectra System (Thermo Separation Products, Inc., USA) s UV6000 FLP detektorem. K separaci analyzovaných látek byla použita vysoce selektivní RP-HPLC kolona Dionex Acclaim OA (250 mm x 4 mm), určená zejména pro analýzu hydrofilních alifatických a aromatických organických kyselin a pro mobilní fáze s vodným obsahem až 100 %. Mobilní fází byl 0,1 mol.l⁻¹ KH2PO4, jehož pH bylo upraveno pomocí methansulfonové kyseliny na 2,65. Podmínky separace: Isokratická eluce, průtok mobilní fáze 0,5 ml.min⁻¹, teplota kolony 30 °C. Nástřik vzorku byl 5 μl a detekce a kvantifikace šťavelové kyseliny byla při 280 nm.

Identifikace šťavelové kyseliny byla provedena na základě porovnání retenčních časů se standardem, kvantifikace byla provedena pomocí kalibrační přímky.

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Byla ověřena linearita kalibrační přímky šťavelové kyseliny v rozsahu 5 až 50 mg.l⁻¹. Korelační koeficient byl 0,9990. Mez kvantifikace byla spočítána na 3,7 mg.kg⁻¹, RSD byla 0,7 %. Výtěžnost byla spočítána metodou standardního přídavku a pohybovala se v rozmezí 80 až 85%.

Ve vzorcích ječmene (obr. 1) byly naměřeny hladiny šťavelanů rozpustných ve vodě v rozmezí 38 až 61 mg.kg⁻¹ sušiny. Jedná se o řádově nižší hodnoty, než byly naměřeny v obilkách pšenice Tritium; zde se hodnoty šťavelanů pohybovaly v rozmezí 530 až 770 mg.kg⁻¹ sušiny (9). Nejnižší hladiny rozpustných i nerozpustných šťavelanů byly nalezeny ve skupině vzorků, které nebyly uměle infikovány ani ošetřeny fungicidem. V obou skupinách vzorků, které byly uměle infikovány, byly nalezeny hladiny šťavelanů vyšší. Z výsledků je patrné, že po napadení obilky Fusarii nemělo ošetření fungicidem signifikantní vliv na koncentraci šťavelanů v ječmeni. Nerozpustný šťavelan vápenatý tvořil v ječmeni 28 až 54 % z celkového obsahu šťavelanů.

Obr. 1 Obsah šťavelanů v ječmeni

Na obr. 2 jsou znázorněny výsledky obsahu šťavelanů ve vzorcích analyzovaného sladu. Při procesu sladování došlo k dvoj- až pětinásobnému nárůstu obsahu vodorozpustných šťavelanů, koncentrace se pohybovaly v rozmezí 110 až 217 mg.kg⁻¹ sušiny, což je v souladu s daty uvedenými v literatuře (10). Naproti tomu obsahy šťavelanu vápenatého ve sladu byly výrazně nižší, než ve vzorcích ječmene, a tvořily maximálně 15 % z celkového obsahu šťavelanů.

Obr. 2 Obsah šťavelanů ve sladu

V analyzovaných vzorcích nebyl nalezen výrazný rozdíl v hladinách šťavelanů v závislosti na odrůdě, v průměru však byly nejvyšší hladiny šťavelanů v ječmeni i ve sladu naměřeny u odrůd Malz a Sebastian.

Ve vzorcích připravených sladin byly vzhledem k odfiltrování pevných zbytků analyzovány pouze obsahy rozpustných šťavelanů. Pro srovnání s obsahem šťavelanů v ječmeni a ve sladu byly hodnoty přepočteny na navážku sladové mouky, použité pro rmutování. Hladiny šťavelanů ve sladině jsou znázorněny na obr. 3 – pohybovaly se v rozmezí 145 až 235 mg.kg⁻¹ sušiny.

Obr. 3 Obsah šťavelanů ve sladině

4 ZÁVĚR

Ke stanovení obsahu oxalátů rozpustných ve vodě a šťavelanu vápenatého byla použita vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi s UV detekcí. Metoda byla optimalizována a validována. Při sladování ječmene dochází k nárůstu hladin celkových šťavelanů, ve sladu byly naměřeny až 5x vyšší hodnoty než v obilce ječmene, ale obsah nerozpustného šťavelanu vápenatého je oproti ječmeni výrazně nižší.

Celková koncentrace šťavelanů v ječmeni se pohybovala v rozmezí 60 až 101 mg.kg⁻¹ sušiny, zatímco ve sladu se pohybovala v rozmezí 113 až 225 mg.kg⁻¹ sušiny. Ve sladině se koncentrace šťavelanů rozpustných ve vodě pohybovala v rozmezí 145 až 235 mg.kg⁻¹ sušiny.