HPLC – Nová cesta pro stanovení karbonylů v pivu

Karbonylové sloučeniny, a to zejména aldehydy, i ve velmi nízkých koncentracích významně ovlivňují chuť piva, protože u většiny z nich je nízká i prahová koncentrace vnímání. Proto patří v pivovarství mezi nejintenzivněji sledované látky.

Autoři příspěvku se při stanovení karbonylových sloučenin zaměřili na využití kapalinové chromatografie, a to zejména v kombinaci s extrakcí na pevné fázi (SPE) za současné derivatizace 2,4-dinitrofenylhydrazinem (DNPH). Stanovovány byly následující sloučeniny: acetaldehyd, diacetyl, furfural, 2-ethylbutanal, 3-methylbutanal, 2-methylpropanal, pentanal, hexanal a (E)-2-nonenal. Byla změřena spektra jednotlivých hydrazonů, a stanoveny obsahy karbonylových sloučenin ve vybraných běžně komerčně dostupných pivech. Byly zjištěny obsahy jednotlivých látek, které jsou v souladu s dříve publikovanými koncentracemi, stanovenými pomocí jiných analytických metod.

1 ÚVOD

Karbonylové sloučeniny, zejména aldehydy, významně ovlivňují chuť piva.Tyto sloučeniny v pivu vznikají během výroby piva řadou cest: Streckerovou degradací aminokyselin, oxidací isohumulonů, oxidací vyšších alkoholů, oxidační degradací lipidů, aldolovou kondenzací aldehydů a sekundární oxidací nenasycených vyšších aldehydů. I když koncentrace těchto látek v pivu je velmi nízká, je u většiny z nich nízká i prahová koncentrace vnímání, a vzhledem k cizím chutím a vůním, které způsobují, patří v pivovarství mezi nejintenzivněji sledované látky.

Běžně se karbonylové sloučeniny měří kombinací mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a GC-MS. Autoři příspěvku se však zaměřili na možnosti využití kapalinové chromatografie zejména v kombinaci s extrakcí na pevné fázi (SPE) za současné derivatizace 2,4-dinitrofenylhydrazinem (DNPH), která využívá skutečnosti, že karbonylové sloučeniny selektivně reagují s DNPH za vzniku 2,4-dinitrofenylhydrazonů příslušného karbonylu.

Byly vyzkoušeny dvě metody izolace karbonylových sloučenin ze vzorků: metoda využívající stripování dusíkem a následnou izolaci se současnou derivatizací na SPE kolonce, a destilační metoda využívající derivatizaci v roztoku. Stanovovány byly následující sloučeniny: acetaldehyd, diacetyl, furfural, 2-methylbutanal, 3-methylbutanal, 2-methylpropa-nal, pentanal, hexanal a trans-2-nonenal. Byla změřena spektra jednotlivých hydrazonů a stanoveny obsahy karbonylových sloučenin ve vybraných běžně komerčně dostupných pivech. Byly zjištěny obsahy jednotlivých látek, které jsou v souladu s dříve publikovanými koncentracemi, stanovenými pomocí jiných analytických metod.

2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

Účelem práce bylo vyvinout metodu umožňující izolaci, zakoncentrování a stanovení karbonylových sloučenin ve vzorcích piv.Principem derivatizačního kroku je reakce uvedená na obr. 1.

Obr. 1 Schéma reakce karbonylové sloučeniny s 2,4-dinitrofenylhydrazinem

2.1 Izolace na SPE kolonce

Metoda s využitím SPE kolonek a derivatizací 2,4-dinitrofenylhydrazinem byla zatím použita pouze pro stanovení karbonylových sloučenin ve vzduchu nebo jiných plynných směsích. SPE kolonka se skládá z inertního nosiče silikagelu, který je potažen vrstvou derivatizačního činidla 2,4-dinitrofenylhydrazinu. Pro průběh derivatizace je dále nezbytné kyselé prostředí kyseliny fosforečné, která snižuje pH na kolonce až na hodnotu 1. Karbonylové sloučeniny byly vytěsňovány z 250 ml piva dusíkem po dobu 3 hodin, přičemž plyn následně procházel kolonkou, na níž se karbonyly derivatizovaly a po proběhnutí stripovacího kroku byly eluovány 30 ml acetonitrilu. Získaný roztok byl analyzován pomocí HPLC.

2.2 Izolace destilací s vodní párou

Vodní párou bylo přeháněno 500 ml vzorku. Odebíráno bylo 60 ml destilátu, ke kterému bylo přidáno 0,25 g 2,4-dinitrofenylhydrazinu a 1 ml kyseliny fosforečné pro úpravu pH. Derivatizace probíhala po dobu 30 minut, pak byl destilát přefiltrován. Sraženina byla rozpuštěna v acetonitrilu a analyzována HPLC.

2.3 Chromatografický systém

• Chromatograf: WATERS Alliance
• Detektor: PAD detektor WATERS 2226
• Kolona: WATERS Novapak C18 150x3,9 mm
• Mobilní fáze: gradient voda:ACN (5–84% ACN)
• Teplota: 35 °C
• Délka analýzy: 65 min

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Při vývoji metody byla optimalizována řada parametrů (doba destilace, pH a doba derivatizace) za účelem maximalizace výtěžků hydrazonů. Bohužel bylo zjištěno, že metoda izolace pomocí SPE je pro naše vzorky nevhodná, takže jsme se soustředili pouze na metodu založenou na destilaci s vodní párou a derivatizaci v roztoku. Standardní roztoky stanovovaných karbonylů byly připravovány pipetováním 10 μl každé čisté standardní látky do příslušného množství 0,2% roztoku derivatizačního činidla DNPH v přítomnosti kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 1 mol/l. Vzniklá sraženina byla z roztoku odfiltrována, promyta vodou a rozpuštěna ve 100 ml acetonitrilu.

3.1 Doba destilace

Pro přípravu roztoků na zjištění výtěžnosti za různých podmínek bylo připraveno 500ml 5% roztoku ethanolu a do něj bylo napipetováno 10 μl každého standardu. Tento roztok byl pak přeháněn s vodní párou. Byla zjišťována výtěžnost pro tyto objemy odebraného destilátu: 15 ml, 30 ml, 60 ml, 90 ml. K odebranému destilátu bylo přidáno potřebné množství DNPH a kyselinou fosforečnou upraveno pH na 3. Směs se nechala reagovat po dobu 30 minut za neustálého míchání. Dále byl odfiltrovaný pevný podíl rozpuštěn v 40 ml acetonitrilu a analyzován. Z výsledků v tab. 1 je jasně patrno, že pro dostatečnou izolaci postačuje doba destilace odpovídající odběru 60 ml destilátu.

Tab. 1 Obsah karbonylových sloučenin získaných různě dlouhými destilacemi

3.2 Délka derivatizace

Nezbytná doba derivatizačního kroku byla stanovena pomocí standardních roztoků jednotlivých aldehydů, přičemž byly analyzovány vzorky po proběhlých 10, 20, 25 a 30 minutách derivatizace. Bylo zjištěno, že zatímco některé aldehydy (např. 2-methylbutanal) reagují prakticky okamžitě a se 100% výtěžkem, jiné (trans-2-nonenal) potřebují pro úplné zreagování i několik desítek minut. Na obr. 2 je patrná výrazná časová závislost výtěžku trans-2-nonenalu.

Obr. 2 Závislost výtěžku trans-2-nonenalu na době derivatizace

3.3 Závislost výtěžku na pH derivatizační reakce

Protože reakce karbonylových sloučenin s DNPH je silně závislá na pH prostředí, bylo třeba zjistit nejvhodnější pH pro maximalizaci výtěžku. Roztoky standardů byly upraveny kyselinou fosforečnou na pH 1, 2, 3 a 5 a podrobeny reakci s DNPH. Bylo zjištěno (obr. 3), že optimální pH leží v rozmezí 2,5-3,5. V tomto rozmezí pak byly prováděny všechny analýzy reálných vzorků.

Obr. 3 Závislost výtěžku derivatizace na pH roztoku

3.4 Stabilita získaných hydrazonů

Získané hydrazony byly skladovány po dobu 4 dní v lednici respektive při pokojové teplotě. Z hodnot uvedených na obr. 4 a 5 je patrné, že hydrazony jsou za těchto podmínek zcela stálé.

Obr. 4 Stabilita derivátů za nízké teploty

Obr. 5 Stabilita derivátů za pokojové teploty

3.5 Stanovení obsahu karbonylů ve vzorcích piv

Byly analyzovány vzorky běžně komerčně dostupných výčepních piv. Karbonyly byly z piv izolovány destilací podle metody uvedené výše. Výsledky jsou shrnuty v tab. 2 a je z nich patrné, že obsahy karbonylů jsou u jednotlivých piv v některých případech odlišné, což je vzhledem k rozmanitosti použitých výrobních technologií pochopitelné. Důležitým závěrem pak je, že se hodnoty obsahů rámcově shodují s obsahy změřenými pomocí jiných metod.

Tab. 2 Obsah karbonylových sloučenin ve vzorcích výčepních piv

4 ZÁVĚR

2,4-dinitrofenylhydrazony jsou vhodné pro stanovení karbonylových sloučenin díky své vysoké reakční specifitě a poměrně vysoké reakční rychlosti. Molekuly 2,4-dinitrofenylhydrazonů mají charakteristická absorpční spektra v ultrafialové oblasti a lze je podle nich snadno identifikovat. Další výhodou těchto derivátů je jejich stabilita v roztoku minimálně po dobu pěti dnů i při pokojové teplotě. Nevýhodou kapalinové chromatografie pro stanovení 2,4-dinitrofenylhydrazonů je vysoká mez detekce, která neumožňuje spolehlivé stanovení trans-2-nonenalu za daných podmínek separace a detekce. Dále byly zjištěny optimální parametry pro průběh derivatizační reakce: nejvyššího výtěžku bylo dosaženo při pH okolo 3, přičemž derivatizace musí trvat minimálně 30 minut. Byly stanoveny obsahy karbonylů ve vzorcích komerčních piv. Jednotlivá piva se z hlediska obsahu karbonylových sloučenin liší na základě způsobu výroby a následné stabilizace, nicméně hodnoty jsou srovnatelné s hodnotami zjištěnými pomocí GC-MS.