Doporučuji se propít ke zdraví - Stanovení antioxidantů pomocí FIA-ECD a UHPLC-MS

Od roku 2018 se na našem pracovišti Institutu Nutrice a Diagnostiky s.r.o. v Pardubicích zabýváme průtokovou injekční analýzou ve spojení s multikanálovou elektrochemickou detekcí (FIA-ECD). K téhle originální metodě jsme dospěli po více než 20 letech zkušeností s elektrochemickou detekcí HPLC. FIA-ECD se ukazuje jako jediné možné řešení pro hodnocení antioxidačních látek ve stovkách vzorků extraktů z ovoce, listů, kůry stromů a bylin. Zajímavým zjištěním je i sledování celkové antioxidační aktivity moči ve vztahu k lidskému zdraví.

V případě zájmu o stanovení konkrétních látek ve víně (ve vztahu ke zdraví např. resveratrol, rutin, quercetin) je na našem pracovišti volena metoda UPLC-MS/MS (Thermo Fisher Scientific – Ultimate 3000/TSQ Quantum Access Max) – vysokoúčinná kapalinová chromatografie s detekcí na trojitém kvadrupólu.

Oldschooler's s jsou rozhovory s Tomášem Nezmeškalem, kde veteráni z veřejného prostoru odhalují příběhy a historky, které od nich ještě nezazněly.

Stanovení celkové antioxidační aktivity v biologickém materiálu pomocí FIA-ECD metody

Naše laboratoř se dlouhodobě zabývá využití elektrochemie pro studium bioaktivních látek. Byla vyvinuta metoda průtokové injekční analýzy s elektrochemickou detekcí (FIA-ECD) pro hodnocení celkové antioxidační aktivity nápojů, potravních doplňků a extraktů z ovoce, listí a bylin. Tato metoda je založená na měření náboje v μC a poskytuje objektivní srovnání schopností antioxidačních látek předávat náboj nezávisle na matrici. Byla použita pro hodnocení celkové antioxidační aktivity lidské moče. Metoda poskytuje velmi zajímavé srovnání.

RADANAL: Obrázek 1: Vzorky moči analyzované FIA-ECD.

FIA-ECD

Přístrojové vybavení pro FIA-ECD:

• Model 582 Solvent Delivery Module
• Model 542 HPLC Autosampler
• Elektrochemický detektor Coularray Detector ESA, Model 5600A (ESA Inc, USA)

FIA-ECD podmínky:

• Mobilní fáze: 90 % KH2PO40,05M + 10% ACN (pH 4,8)Průtok: 1 ml/min
• Isokratický proces
• Nástřik: 10 μl
• Potenciály: 200, 400, 600 a 800 mV
• Čas analýzy: 1,1 min
• Vzorek zředěný mobilní fází 1 : 3 (plná moč : mobilní fáze)

RADANAL: Obrázek 2: Přístrojové vybavení pro FIA-ECD - pumpy, autosampler, CoulArraydetektor a analyzátor

HPLC-MS/MS

Přístrojové vybavení pro HPLC-MS/MS:

• UltiMate 3000 Binary RSLC
• TSQ Quantum Access Max s ionizací elektrosprejem H–ESI (ThermoFisher Scientific, USA)

HPLC podmínky:

Kolona: Kinetex F5 100 Å 1,7 μm 50 x 2,1 mm (Phenomenex)

• Univerzální předkolona: Zorbax Eclipse XDB-C18, 4,6 x 5 mm, 1,8μm (Agilent)
• Mobilní fáze A: 0,1 obj. % kyseliny mravenčí ve vodě
• Mobilní fáze B: 0,1 obj. % kyseliny mravenčí v methanolu

MS Parametry:

• Ionizační mód: ESI+
• Scenovací mód: SRM
• Čas skenovacího cyklu: 0,5 s
• Tlak kolizního plynu: 1,5 mTorr
• Teplota kapiláry: 325 °C
• Teplota odpařovací jednotky: 300 °C
• Tlak sušícího plynu: 45 arb units
• Tlak čistícího plynu: 2 arb units
• Hodnota sprejovacího napětí: 3300 V

Výsledky

Pomocí vyvinuté FIA-ECD metody byla zjištěna celková antioxidační aktivita ve vzorcích sbírané moči šedesátiletého dobrovolníka v období prosinec 2017 až listopad 2018 (celkem 281 vzorků). Ve vzorcích byly pomocí HPLC-MS/MS kvantifikovány markery oxidačního poškození DNA (8-hydroxy-2'-deoxyguanosin) a RNA (8-hydroxyguanosin).V rámci studie byla posuzována souvislost mezi hladinami markerů poškození nukleových kyselin v moči a hladinami antioxidační aktivity lidské moče.

RADANAL: Obrázek 3: Stanovení celkové antioxidační aktivity ve vybraných vzorcích pomocí průtokové injekční analýzy s elektrochemickou detekcí.

Průměrná hodnota antioxidační aktivity vzorků moči (FIA-ECD) byla nalezena 360 ± 128 µC/ml a pohybovala se od 88 µC/ml do 872 µC/ml. Koncentrační hladiny biomarkerů sledovaných metodou HPLC-MS/MS se pohybovaly v rozmezí hodnot 1,5 - 163 ng/ml (8-hydroxyguanosin) a 0,1 - 103 ng/ml (8-hydroxy-2´-deoxyguanosin). Průběh nalezených koncentračních hladin analytů nekoreloval s antioxidační aktivitou moče. Bylo zjištěno, že z hlediska antioxidační aktivity může být lidská moč hodnotnější než kvalitní červené víno.

RADANAL: Obrázek 4: Grafické srovnání výsledků měření celkové antioxidační aktivity plné moče metodou FIA-ECD a měření koncentrace dvou biomarkerů metodou UPLC-MS/MS