Online IEX-MS Characterization and Monitoring of mAb Charge Heterogeneity Using an Optimized Cation Exchange Resin and Compact TOF Mass Spectrometer

Význam tématu

Ion­tové výměnné chromatografie (IEX) ve spojení s hmotnostní spektrometrií umožňují detailní analýzu nábo­jové heterogenity monoklonálních protilátek, což je klíčové pro hodnocení stability bioterapeutik a jejich biologické aktivity.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit online IEX-MS metodu pro rychlou separaci a identifikaci nábojových variant monoklonálních protilátek (mAb) bez potřeby frakční kolekce či vnější výměny pufru. Metoda byla demonstrována na modelu trastuzumabu podrobeného nucené degradaci pH stresem.

Použitá metodika a instrumentace

Pro chromatografii byla použita kolona ACQUITY BioResolve SCX (3 µm, 2.1 × 50 mm) na UPLC systému ACQUITY I-class s TUV detektorem. Mobilní fáze obsahovaly MS-kompatibilní těkavé směsi solí a dualní pH gradient. Pro detekci intactní hmotnosti a subjednotek sloužil kompaktní TOF spektrometr RDa (BioAccord), řízený softwarem UNIFI.

Hlavní výsledky a diskuse

IdeS digest trastuzumabu ukázal rozdělení na fragmenty Fc/2 a Fab s dobře separovanými kyselými, hlavními a bazickými formami. Po jednom týdnu pH 8 stresu došlo ke zvýšení podílu kyselých variant Fab o 14,1 % a Fc o 4,5 %. V nonredukované formě se celkový podíl kyselých variant zvýšil o 18,7 %. MS dekonvoluce umožnila přiřazení modifikací (deamidace, C-terminální lyzin, možné disulfidové či konformační změny).

Přínosy a praktické využití metody

• Online IEX-MS bez frakční kolekce šetří čas a eliminuje artefakty vzniklé manipulací.
• Volatilní pufry a optimalizovaný resin zaručují kompatibilitu s native MS.
• Metoda je vhodná pro rutinní QA/QC a stabilitní studie v biopharma průmyslu.
• Umožňuje cílené vyšetření i téměř isobarických variant.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření IEX-MS pro sledování glykačních či dalších PTM, integrace 2D-LC spojení s peptidovou mapou pro lokalizaci modifikací a zrychlený screening nových kandidátů v preklinickém vývoji.

Závěr

Studie prokázala spolehlivost a efektivitu online IEX-MS workflowu pro charakterizaci a monitorování nábojové heterogenity mAb. Kompaktní TOF MS a optimalizovaný resin umožňují rychlé rozlišení a přímé potvrzení modifikací bez dodatečné přípravy vzorku.

Reference

1. Yan Y et al. Ultrasensitive Characterization of Charge Heterogeneity of Therapeutic Monoclonal Antibodies Using Strong Cation Exchange Chromatography Coupled to Native Mass Spectrometry. Anal Chem. 2018;90(21):13013–13020.
2. Leblanc Y et al. Charge variants characterization of a monoclonal antibody by ion exchange chromatography coupled on-line to native mass spectrometry: Case study after a long-term storage at +5 °C. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2017;1048:130–139.
3. Fussl F et al. Charge Variant Analysis of Monoclonal Antibodies Using Direct Coupled pH Gradient Cation Exchange Chromatography to High-Resolution Native Mass Spectrometry. Anal Chem. 2018;90(7):4669–4676.
4. Diepold K et al. Simultaneous Assessment of Asp Isomerization and Asn Deamidation in Recombinant Antibodies by LC-MS Following Incubation at Elevated Temperatures. PLoS ONE. 2012;7(1):e30295.