Separation and Analysis of Low Molecular Weight Organic Acid Metabolites by Mixed-Mode Chromatography Coupled to Mass Spectrometry

Význam tématu

Metabolity citrátového (TCA) cyklu tvoří klíčové ukazatele buněčného dýchání a energetického stavu organismu. Díky své malé molekulární hmotnosti a vysoké polarity je jejich analýza náročná. Standardní RP metody často neposkytují dostatečnou retenci ani selektivitu, což komplikuje rozlišení izobarických párů, jako jsou citrát a isocitrát. Implementace spolehlivého a rychlého přístupu pro kvantifikaci těchto organických kyselin má významné dopady v biochemickém výzkumu, klinické diagnostice či monitorování metabolických poruch.

Cíle a přehled studie

Studie sleduje zavedení nového chromatografického protokolu pro nederivativní separaci nízkomolekulárních organických kyselin z moči pacientek s karcinomem prsu. Hlavní cíle:

• Optimalizovat separaci a retenci TCA metabolitů bez iontově párovacích činidel.
• Uplatnit metodu na reálné vzorky moči pro odhalení odlišností mezi zdravými a onkologickými pacientkami.
• Vyhodnotit výsledky pomocí pokročilé statistické analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky moči byly ředěny deionizovanou vodou, centrifugovány a analyzovány bez předchozí derivatizace. Separace proběhla na UPLC systému ACQUITY I-Class s kolonou CSH Phenyl-Hexyl (2,1×100 mm, 1,7 µm) při 60 °C. Mobilní fáze A byla voda s 0,1 % kyseliny mravenčí, fáze B acetonitril s 0,1 % kyseliny mravenčí. Gradient šel z 0 do 25 % fáze B za 4 minuty při průtoku 0,4 ml/min. Detekce byla realizována pomocí hmotnostního spektrometru Xevo G2-XS TOF v negativním ionizačním módu s MSe akvizicí.
Software pro zpracování dat zahrnovalo MassLynx 4.1, Progenesis QI a EZinfo pro multivariační statistiku.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla dobré retence standardních metabolitů TCA cyklu (laktát 1,0 min, malát 1,15 min, sukcinát 1,2 min, isokitrát 1,4 min, citrát 1,8 min apod.). Separace moči zdravých i karcinomových vzorků vykázala jasné odlišení v PCA a OPLS-DA modelech. Bylo identifikováno několik markerů s významnou změnou abundancí (např. ionty m/z 363,0280 při tR 3,34 min a 295,0894 při tR 0,83 min), které byly následně přiřazeny pomocí databází HMDB, KEGG a METLIN.
Navržené identity klíčových signálů (např. xanosinmonofosfát, dipeptid kyselina asparagová-tyrosin) budou potvrzeny komerčními standardy.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený postup umožňuje:

• Rychlou a reprodukovatelnou analýzu polárních organických kyselin bez nutnosti derivatizace.
• Spolehlivou diferenciaci klinických skupin na základě metabolického profilu moči.
• Možnost širší aplikace v metabolomice, klinické diagnostice a farmakologickém výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda lze rozšířit o kvantitativní modul s použitím izotopově značených standardů. Integrace dalších režimů ionizace (pozitivní mód) a implementace cílených MRM metod by mohla zvýšit citlivost a specifičnost pro nízkokoncentrované analyty. Kombinace s technikami kapalinové chromatografie s vysokým rozlišením (HR-LC) či online frakcionací může dále rozšířit metabolomický pokrytí.

Závěr

Předložená mixed-mode UPLC-TOF MS metoda nabízí efektivní řešení pro analýzu TCA cyklu a souvisejících organických kyselin v biologických vzorcích. Metoda prokázala schopnost statisticky významně rozlišit metabolické profily zdravých a karcinomem ovlivněných vzorků.
Další validace s komerčními standardy a rozšíření metodiky napomohou k její aplikaci v rutinní klinické praxi a výzkumu.

Reference

Smith K.M., Rainville P.D. Mixed-Mode Chromatography Coupled to Mass Spectrometry for Low Molecular Weight Organic Acid Metabolites. Waters Corporation, 2019.