Fraction Analysis of Cysteine‑Linked Antibody-Drug Conjugates Using Hydrophobic Interaction Chromatography

Význam tématu

Hydrofobní interakční chromatografie umožňuje detailní analýzu heterogenity cysteiny vázaných terapeutických protilátek konjugovaných s malými molekulami. Přesné stanovení poměru lékové zátěže (DAR) je zásadní pro zajištění bezpečnosti, účinnosti a stability biofarmaceutik. Plně bioinertní chromatografický systém eliminuje korozi způsobenou vysokými koncentracemi solí a zvyšuje spolehlivost dlouhodobých analýz.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo ukázat frakční sběr hlavních špiček brentuximab vedotinu po HIC na Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert LC a Bio-Inert Fraction Collectoru a potvrdit přesnost separace opětovnou analýzou pomocí HIC i reverzní fáze.

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert Pump G5654A
• Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert Multisampler G5668A s chlazením vzorku
• Agilent 1260 Infinity II Multicolumn Thermostat G7116A s bio-inertním výměníkem tepla
• Agilent 1260 Infinity II Diode Array Detector WR G7115A s bio-inertní tokovou kyvetou
• Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert Fraction Collector G5664B
• Agilent OpenLAB CDS ChemStation Edition C.01.07 SR3
• HIC kolona generic HIC column a Agilent PLRP-S 300 Å, 2.1 × 50 mm, 3 µm (PL1912-1301)

Metodika

HIC separace probíhala gradientem mobilních fází A (2 M NH4SO4 v 100 mM fosfátovém pufru pH 7), B (100 mM fosfát pH 7) a C (isopropanol) při 0,4 mL/min a 30 °C. Frakční sběr využíval kombinaci peakového spouštění a objemového řezání pro přesné zachycení špiček. Frakce byly redukovány TCEP při 37 °C po dobu 1 h a dále analyzovány reverzní fází na PLRP-S kolóně při 90 °C s gradientem vody a acetonitrilu s 0,1 % TFA při 0,3 mL/min.

Hlavní výsledky a diskuse

• HIC separace brentuximab vedotinu generovala pět špiček odpovídajících DAR 0, 2, 4, 6 a 8.
• Frakční kolektor prokázal vysokou přesnost sběru jednotlivých frakcí bez ztrát, potvrzenou opětovnou HIC analýzou.
• Reverzní fázová analýza odhalila složení frakcí: LC, LC+1, HC, HC+1, HC+2 a HC+3.
• Bioinertní průtoková cesta zabránila korozi a zajistila konzistenci měření při vysoké koncentraci solí.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje izolaci a kvantifikaci jednotlivých DAR forem ADC s vysokou spolehlivostí. Ulehčuje vývoj a kontrolu kvality biokonjugátů v laboratořích výzkumu i v průmyslové výrobě.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj semi-preparativních HIC postupů pro hromadné purifikační aplikace a online monitoring frakcí. Integrace s dalšími technikami, jako je hmotnostní spektrometrie, rozšíří analytické možnosti komplexní charakterizace ADC a dalších biokonjugátů.

Závěr

Frakční HIC analýza brentuximab vedotinu s precizním peakovým sběrem na bioinertním systému potvrdila efektivitu a reprodukovatelnost separace DAR forem. Reverzní fázová reanalýza podpořila přesnost identifikace. Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert LC s fraction collectorem představuje robustní řešení pro charakterizaci ADC.

Reference

• Schneider S. Analysis of Cysteine linked Antibody Drug Conjugates using Hydrophobic Interaction Chromatography on the Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert LC. Agilent Application Note 5991-8493EN, 2017.
• Younes A. et al. Brentuximab Vedotin for Relapsed CD30-Positive Lymphomas. N Engl J Med. 2010;363:1812–1821.
• Wakankar A. et al. Analytical methods for physiochemical characterization of antibody drug conjugates. mAbs. 2011;3(2):161–172.