MALDI-nanochip based Screening of Exosomal Biomarkers: Application to Cancer Diagnostics

Význam tématu

Exozomy jsou malé nanočástice uvolňované buňkami a obsahují řadu proteinových markerů odrážejících stav buněk původu. Analýza proteomu exozomů má zásadní význam pro nekontaktní diagnostiku nádorových onemocnění („liquid biopsy“), protože umožňuje rychlé, minimálně invazivní sledování biomarkerů v krevním oběhu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo srovnat proteomický profil exozomů izolovaných z plazmy čtyř skupin pacientů: pre- a postoperativní kolorektální karcinom (CRC), zánětlivé střevní onemocnění (IBD) a zdraví dárci. Hlavním úkolem bylo identifikovat diskriminační proteiny a ověřit výkonnost vysokovýkonného MALDI-nanochipového workflowu pro potenciální klinické použití.

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy vzorků:

• Sběr krve a separace plazmy centrifugací.
• Izolace exozomů sekvenční ultracentrifugací (300 g, 10 000 g, 100 000 g).
• Extrahování proteinů organickým rozpouštědlem, vysušení ve vakuu a skladování při –80 °C.
• On-chip tryptická digestace přímo na MALDI-nanochipu Tethis; alternativně in-solution digestace a vyčištění pomocí C18-ZipTips.
• Nanesení matice (0,5 µL CHCA v ACN:2,5 % TFA) a akvizice hmotnostních spekter.

Hlavní přístroje:

• Shimadzu Axima Performance (lineární benchtop MALDI-TOF)
• Shimadzu MALDI-7090 (TOF/TOF, HE-CID) s FlexiMass-DS targetem
• Software Clover MS Data Analysis a eMSTAT pro statistiku
• Mascot pro identifikaci proteinů (SwissProt/UniProt)

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání spekter v rozsahu m/z 2 000–20 000 ukázalo jasné rozdíly nad m/z 8 000 po isolaci exozomů. Multivariační analýza (PLS-DA) umožnila rozdělení čtyř pacientských skupin. On-chip proces čištění na Tethis slide efektivně odstranil vysoce abundantní proteiny, což vedlo k zesílení signálu méně hojně zastoupených diskriminačních peptidů oproti ZipTip čistění. Mezi naměřenými prekurzory byl cíleně identifikován např. imunoglobulin α-řetězec (IGHA1), ale také další méně hojné proteiny, charakteristické pro jednotlivé skupiny.

Přínosy a praktické využití metody

Platforma MALDI-nanochip nabízí:

• Rychlou, vysoce propustnou analýzu proteomů exozomů přímo z plazmy.
• Možnost diskriminovat pacientské skupiny podle proteomického otisku.
• Snížení interference abundantních proteinů pro odhalení nových biomarkerů.

Metoda je vhodná pro klinické workflowy v onkologii a sledování odpovědi na terapii.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj technologie může směřovat k:

• Automatizaci izolace exozomů a on-chip digestace v jednom zařízení.
• Rozšíření databází biomarkerů pro různé typy nádorů.
• Integraci s dalšími MS metodami (nLC-MS/MS) pro hlubší proteomickou charakterizaci.

Závěr

Studie prokázala, že kombinace nanochipové MALDI-TOF analýzy a sofistikované statistické interpretace umožňuje spolehlivou detekci a identifikaci exozomálních proteinových markerů pro diagnostiku kolorektálního karcinomu a dalších patologií. Platforma představuje nadějný nástroj pro rychlé a neinvazivní klinické vyšetření.

Reference

• Serafim V. et al. Classification of cancer cell lines using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry and statistical analysis. International Journal of Molecular Medicine, 40, 1096–1104 (2017).
• Stübiger G. et al. MALDI-MS Protein Profiling of Chemoresistance in Extracellular Vesicles of Cancer Cells. Analytical Chemistry, 90, 13178–13182 (2018).