High-throughput tandem capillary-flow LC-MS for maximum MS utilization

Význam tématu

Vysoká efektivita využití hmotnostního analyzátoru (MS) je v proteomice klíčová pro rychlé zpracování vzorků a nákladově efektivní provoz laboratoře. Tradiční nano-flow LC-MS dosahuje vysoké citlivosti, avšak při krátkých cyklech trpí vysokou mírou nečinnosti MS. Capilární-flow LC-MS představuje kompromis mezi citlivostí a propustností, avšak pro další zvýšení efektivity je nutné řešení umožňující kontinuální nasávání peptidů.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři popisují vývoj tandemového capilárního LC-MS systému, který využívá dva paralelně pracující analytické sloupce, inteligentní přepínání ventilů a „look ahead“ injekce. Hlavním cílem bylo maximalizovat dobu, po kterou MS sbírá data, směrem k 100 % při zachování citlivosti a hloubky proteomového pokrytí. Ukazuje se, že 7minutové režimy umožňují průtok až 200 vzorků za den s eluci peptidů trvající 6,8 minuty.

Použitá metodika a instrumentace

Popisované uspořádání zahrnuje UltiMate 3000 RSLCnano systém s dvěma čerpadly (NCS-3500RS pro gradientní eluci, NCP-3200RS pro mytí a ekvilibraci), WPS-3000TPL autosampler s pull-loop injekcí a dvě analytické C18 kolony Acclaim PepMap 100 (75 µm×15 cm). MS část tvoří Q Exactive HF-X s Nanospray Flex ionizačním zdrojem. Klíčové prvky metody:

• Paralelní mytí a ekvilibrace druhého sloupce během eluce prvního sloupce.
• „Look ahead“ injekce pro načtení a koncentrování dalšího vzorku bez prodlevy.
• Inteligentní přepínání 10portových ventilů pro plynulý přechod mezi kolony.
• Zavedení post-column diverze toku pro minimalizaci mrtvých časů.

Hlavní výsledky a diskuse

Implementace tandemového LC uspořádání dosahuje prakticky 97–100 % využití MS v 7minutových cyklech. Bázový chromatogram pro HeLa digesty ukazuje téměř kontinuální přísun peptidů po dobu 6,8 minuty. Ve srovnání s jednokolonovým 8minutovým režimem se počet záznamů MS/MS (PSMs) i identifikovaných proteinových skupin zvýšil (z 972 na více než 1100 proteinů). Zvýšené šířky vrcholů způsobené mírně vyšší post-column dispersí nepoklesly dopad na celkovou kvalitu dat.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Výrazné zkrácení doby analýzy bez kompromisů v citlivosti.
• Maximální využití instrumentálního času pro vysokopropustné laboratoře.
• Flexibilní přizpůsobení délky gradientu podle aplikačních potřeb.
• Jednoduchou integraci do stávajících nanoLC-MS platforem bez rozsáhlých hardwarových úprav.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může směřovat k:

• Optimalizaci pro ještě kratší gradienty (<5 min) nebo vyšší propustnost (>300 vzorků/den).
• Integraci s automatizovanými robotickými systémy pro špičkové screeningové projekty.
• Využití v klinické proteomice a QA/QC pro rychlou kontrolu kvality vzorků.
• Propojení s algoritmy strojového učení pro adaptivní plánování sběru dat v reálném čase.

Závěr

Tandemové capilární-flow LC-MS uspořádání na platformě UltiMate 3000 RSLCnano umožňuje téměř plné využití hmotnostního analyzátoru bez ztráty citlivosti. Sedmiminutové metody přinášejí robustní, vysoce propustné řešení pro moderní proteomické laboratoře.

Reference

1. Zhang X, Gajadhar A, Sun X, Baynham M. A highly sensitive and robust 150 µm column to enable high-throughput proteomics. Thermo Scientific Application Note 21744; January 2018.
2. Boychenko A, Pynn C, van den Berg B, Arrey T, Baynham M, Decrop R, Ruehl M. High-throughput capillary-flow LC-MS proteomics with maximum MS utilization. Thermo Scientific Technical Note 72777; August 2018.
3. Thermo Scientific UltiMate 3000 RSLCnano System – Versatility and Performance – The Ultimate Solution for All Separation Workflows, BR-71898; 2016.
4. Thermo Scientific UltiMate 3000 RSLCnano Standard Applications Guide v3.0; 2018.
5. The Complete and Easy Guide to Configuring your Thermo Scientific Nano LC for Mass Spectrometric Analysis.
6. Thermo Scientific Poster Note 64618. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/posters/PN-64618-LC-MS-Human-Proteomes-Label-Free-Quantitative-Profiling-HUPO2015-PN64618-EN.pdf