Maximizing proteome coverage through improved on-line Orbitrap peak determination

Význam tématu

Rostoucí hloubka proteomových analýz vyžaduje efektivní identifikaci a vzorkování prekurzorů v reálném čase. Tradiční THRASH algoritmus již nedostačuje pro plné využití možností moderních Orbitrap Fusion Lumos Tribrid hmotnostních spektrometrů, což omezuje pokrytí komplexních biologických vzorků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo implementovat a otestovat nový algoritmus Advanced Peak Determination (APD) pro on-line stanovení špiček v Orbitrap spektrech. Studie porovnává výkon APD se stávajícím THRASH algoritmem při analýze tryptických HeLa peptidů i intact protein standardu.

Použitá metodika a instrumentace

• Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer
• Thermo Scientific Easy-nLC 1000 a Dionex UltiMate 3000 UHPLC systémy
• Data-dependent LC-MS/MS metody s rychlým (turbo) skenováním ITMS2, automaticky určeným hmotnostním rozmezím a variabilním maximálním injekčním časem (optimálně 20–35 ms)
• Vzorky: Pierce HeLa digest (1 μg) a Pierce Intact Protein Standard mix
• Vyhledávání: Thermo Scientific Proteome Discoverer 2.1, Percolator, 1 % FDR

Hlavní výsledky a diskuse

• APD detekuje stovky tisíc dodatečných prekurzorů díky lepšímu rozlišení překrývajících se izotopických obálek a přesnějšímu přiřazování nábojového stavu.
• Při zapnutém APD se během 2hodinové LC-MS/MS analýzy získalo přibližně 250 000 MS2 spekter, což vedlo k >45 000 unikátním peptidovým identifikacím, tj. o >35 % více než s THRASH.
• Reprodukovatelnost mezi třemi replikami se zlepšila, počet peptidů identifikovaných ve všech třech bězích vzrostl o ~50 % (z 26 158 na 38 045).
• Optimalizované parametry ITMS2 (maximální injekční čas 20 ms, rychlý skenovací režim, 200–1400 m/z) vyváží kvalitu spekter a vysokou akviziční frekvenci přes 35 Hz.
• APD rovněž zlepšuje stanovení nábojového stavu velkých biomolekul, což umožňuje pokročilé top-down analýzy intaktních proteinů.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazně vyšší proteomové pokrytí při zachování nebo zkrácení doby analýzy.
• Lepší reprodukovatelnost a detekční limity, vhodné pro náročné QA/QC aplikace, farmaceutický výzkum a klinické studie.
• Možnost rutinního nasazení APD algoritmu na Orbitrap Fusion Lumos platformách v analytických laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace strojového učení pro další vylepšení detekce špiček a predikci izotopických vzorů.
• Rozšíření APD do dalších hmotnostních spektrometrů a top-down proteomiky s cílem detailního studia posttranslačních modifikací.
• Využití při real-time rozhodování o selekci prekurzorů pro dynamicky řízené experimenty.

Závěr

Nový algoritmus Advanced Peak Determination významně posiluje schopnost Orbitrap Fusion Lumos Tribrid spektrometrů, zvyšuje počet identifikovaných peptidů i přenositelnost metodiky pro top-down analýzy. Díky optimalizovaným ITMS2 nastavením a lepší detekci izotopických obálek dosahuje >35 % zlepšení v proteomové pokrytí a lepší reprodukovatelnosti.

Reference

1. Hoopmann MR, Finney GL, MacCoss MJ. High speed data reduction, feature selection, and MS/MS spectrum quality assessment of shotgun proteomics datasets using high resolution mass spectrometry. Anal. Chem. 2007, 79, 5630-5632.
2. Senko MW, Beu SC, McLafferty FW. Automated assignment of charge states from resolved isotopic peaks for multiply charged ions. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1995, 6, 52-56.
3. Senko MW, Beu SC, McLafferty FW. Determination of monoisotopic masses and ion populations for large biomolecules from resolved isotopic distributions. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1995, 6, 229-233.
4. Horn DM, Zubarev RA, McLafferty FW. Automated reduction and interpretation of high resolution electrospray mass spectra of large molecules. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2000, 11, 320-332.