Optimizing the Isolation Width in Orbitrap Instruments to Maximize the Number of Label-Free Quantified Peptides and Proteins

Význam tématu

Label Free Quantification (LFQ) je klíčovou metodou v proteomice pro kvantifikaci proteinů bez potřeby izotopických značek. Optimalizace šířky izolace v Orbitrap spektrometrech přispívá k vyššímu počtu identifikovaných a kvantifikovaných proteinů, lepší přesnosti a přesnosti měření.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo určit optimální izolační šířku pro maximální počet identifikovaných a kvantifikovaných proteinů a peptidů v LFQ experimentech na Orbitrap Exploris 480 a Orbitrap Eclipse Tribrid přístrojích. Studie porovnala různé šířky od 0,4 do 4 Th a zkoumala dopad použití FAIMS a nové strategie vyhledávání chimerických spekter.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: Směsi štěpů bílkovin kvasinky a HeLa v poměrech 2, 5, 10 na konstantním 200 ng podkladu.
• Chromatografie: EASY-Spray PepMap RSLC C18 kolona, gradient 8–30 % B za 60 min, následně do 50 % a do 90 % B.
• Spektrometrie: Orbitrap Exploris 480 (široká šířka 0,4–4 Th), Orbitrap Eclipse Tribrid s FAIMS Pro (šířka 3 Th).
• Software: Proteome Discoverer 2.4 s uzlem Precursor Detector, vyhledávače SEQUEST HT a MSPepSearch, FDR 1 % na PSM, peptidové a proteinové úrovni.
• Spektra: Predikce knihoven PROSIT, validace pomocí Percolator a cílově-dekoové strategie.

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimální izolační šířka 3–4 Th vedla k nárůstu identifikovaných proteinových skupin až o 50 % oproti tradičním šířkám.
• Strategie vyhledávání chimerických spekter s více prekurzory (MPS) přinesla vyšší počet PSM, peptidových a proteinových skupin, avšak mírně snížila přesnost u nízce hojně zastoupených proteinů.
• FAIMS Pro významně zlepšila přesnost a reprodukovatelnost kvantifikace a dále zvýšila počet kvantifikovaných proteinových skupin.
• Percolator vykázal vyšší míru identifikace než tradiční cílově-dekoová metoda.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaná šířka izolace a chimerické vyhledávání umožňují laboratořím dosáhnout vyššího pokrytí proteomu, lepší přesnosti kvantifikace a efektivnějších workflows bez dodatečných značkovacích postupů. FAIMS přidává další zlepšení datové kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další vylepšení algoritmů pro rozpoznávání chimerických spekter a strojového učení ve vyhledávacích nástrojích.
• Integrace pokročilých iontových mobilitních separací a víceúrovňových fragmentačních metod.
• Nasazení v klinických a biotechnologických aplikacích s požadavkem na vysokou citlivost a přesnost.

Závěr

Optimalizace izolační šířky kolem 3–4 Th v Orbitrap spektrometrech v kombinaci s vyhledáváním chimerických spekter a FAIMS Pro přináší výrazné zvýšení počtu kvantifikovaných proteinů a zlepšení kvality kvantifikace v LFQ experimentech.

Reference

1. D. Zolg et al., Nature Methods 14, 259 (2017), „Building ProteomeTools based on a complete synthetic human proteome“.
2. S. Gessulat, A. Schmidt et al., Nature Methods (2019), „Prosit: proteome-wide prediction of peptide tandem mass spectra by deep learning“.