Forced-degradation evaluation of erythromycin by HPLC and single quadrupole mass spectrometry

Význam tématu

Erythromycin je makrolidové antibiotikum s nízkou UV absorpcí a složitým profilem biosyntetických variant. Hodnocení jeho stability a tvorby degradačních produktů je zásadní pro vývoj a kontrolu jakosti léčiv. Kombinace kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (LC-MS) umožňuje citlivé stanovení a identifikaci neznámých nečistot bez potřeby standardů, s nižší spotřebou vzorku než u běžné LC-UV analýzy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout jednoduchou, stability-indikující LC-MS metodu pro stanovení erythromycinu a porovnání nečistotného profilu referenčního standardu se vzorkem podrobeným nucené degradaci v kyselém prostředí. Metoda má být fit-for-purpose, snadno přenosná a nevyžadovat rozsáhlou optimalizaci.

Použitá instrumentace

• Kapalinový chromatograf Thermo Scientific Vanquish Core (systémové komponenty: pumpa, autosampler, kolona PolarAdvantage II, kolonní komora).
• Jednokvadrupólový hmotový spektrometr Thermo Scientific ISQ EM s Autospray zdrojem.
• Software Thermo Scientific Chromeleon CDS verze 7.3 pro sběr a zpracování dat.

Metodika

• Fáze: A – voda + 0,1 % kyselina mravenčí; B – methanol/voda (9:1) + 0,1 % kyselina mravenčí.
• Kolona PolarAdvantage II (3 × 150 mm, 3 µm); gradient 50–100 % B (min 0–15), poté návrat na 50 % B; průtok 425 µL/min, teplota kolony 40 °C.
• MS režimy: plný sken (350–1050 m/z) a SIM s výběrem m/z známých variant (734,47; 718,47; 720,45; 748,36; 750,46; 716,44). Nastaveno pozitivní ionizace, ion transfer 250 °C pro snížení termální fragmentace.
• Příprava vzorků: referenční standard 2,8 µg/µL, nuceně degradovaný vzorek (1 N HCl, 1 týden), smíšený na konečnou koncentraci 2,71 µg/µL.

Hlavní výsledky a diskuse

• Nižší ion transfer teplota efektivně eliminuje termální fragmenty erythromycinu ve zdroji, což zjednodušuje kvantifikaci.
• Chromatografické rozlišení erythromycinu B (m/z 718,4) od izobarických nečistot (m/z 716,4) je klíčové pro přesné stanovení.
• Nuceně degradovaný vzorek obsahuje více nízkomolekulárních nečistot než referenční, včetně pěti nových degradátů detekovaných v SIM režimu.
• Spotřeba vzorku (< 3 µg/injekce) je > 100× nižší než doporučená EP LC-UV metoda, přičemž citlivost a selektivita zůstávají vysoké.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlé fit-for-purpose stanovení nečistotního profilu erythromycinu při nucené degradaci s nízkou spotřebou vzorku. Určení složení a relativního obsahu nečistot usnadňuje vývoj a validaci stabilitních studií bez nutnosti jednotlivých referenčních standardů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření o tandemovou hmotovou spektrometrii (MS/MS) pro detailní strukturní identifikaci degradátů.
• Použití vysokorozlišovací MS pro odlišení izobarických nečistot a přesnější stanovení elementárního složení.
• Automatizace zpracování dat a integrace umělé inteligence pro rychlou dekonvoluci komplexních matric.
• Implementace do multi-stresových studií (pH, teplota, oxidace) a rozšíření na jiné makrolidy či biologická léčiva.

Závěr

Vyvinutá LC-MS metoda s jednoduchou HPLC fází a jedním typem kolony prokázala schopnost selectivně a citlivě kvantifikovat erythromycin a jeho degradační produkty. Nízká spotřeba vzorku, robustní nastavení a možnost identifikace neznámých nečistot bez standardů činí přístup vhodným pro rané fáze vývoje léků i rutinní stability testing.

Reference

1. European Pharmacopoeia, Monograph 0179: Erythromycin. EDQM.
2. European Pharmacopoeia Information Leaflet: Erythromycin for system suitability CRS.
3. Chitneni S.K. et al., J. Chromatogr. A 2004, 1056, 111–120.