Optimize Non-Reduced CE-SDS Analysis with the SCIEX Low pH SDS Sample Buffer

Význam tématu

Capilární elektroforéza se sodnou dodecylsulfátovou komplexací (CE-SDS) je základní technikou v biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu pro vyhodnocování integrity a čistoty proteinových léčiv. Umožňuje citlivě detekovat nízkomolekulární fragmenty, vysokomolekulární agregáty a drobné varianty glykosylace. Pro správnou interpretaci a spolehlivost výsledků je zásadní minimalizovat artefakty, zejména disulfidové přeskupování, které může zkreslit rychlost migrace proteinů a jejich kvantifikaci.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem publikace bylo optimalizovat analytickou metodu CE-SDS za nedredukujících podmínek použitím kyselého vzorkovacího pufru (pH 6,8) oproti klasickému zásaditému (pH 9,0). Autoři sledovali, zda nižší pH potlačí nežádoucí tvorbu disulfidových vazeb a sníží míru fragmentace u tří komerčních biosimilárních monoklonálních protilátek (adalimumab, infliximab, drozitumab).

Použitá instrumentace

Pro separaci a detekci byla využita platforma PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System od SCIEX. Klíčové parametry:

• Předmontované křemíkové kapiláry 50 µm ID × 10 cm
• Teplotní kontrola kapiláry na 25 °C se systémem recirkulující chladicí kapaliny
• Injektáž tlakovou injekcí (5 PSI, 65 s)
• Elektroforetická separace při 15 kV (normální polarita)

Hlavní výsledky a diskuse

Srovnání vzorkování v pufru pH 9,0 versus pH 6,8 prokázalo:

• U adalimumabu nárůst podílu hlavního monomerního píku o 2,1 % (ze 94,8 % na 96,9 %) a snížení HHL fragmentu o 0,8 %
• U infliximabu zvýšení hlavního píku o 1,3 % (ze 95,4 % na 96,7 %) a snížení HHL z 2,2 % na 0,9 %
• U drozitumabu vzestup monomerní čistoty o 2,0 % (ze 95,1 % na 97,1 %) a snížení fragmentu HHL téměř o polovinu

Nižší pH potlačilo disulfidové přeskupování a vznik nežádoucích fragmentů migrujících před hlavní špičkou intactní protilátky. Elektoferogramy ukázaly výraznější hlavní píky a kompaktnější separaci, což usnadňuje integraci a kvantifikaci.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizace vzorkovacího pufru na pH 6,8 přináší:

• Vyšší robustnost metody díky snížení artefaktů
• Reprodukovatelnější výsledky v rámci QA/QC procesů a uvolňování šarží
• Lepší shodu s ortogonálními metodami, např. SEC

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může směřovat k:

• Rozšířenému testování na různé třídy proteinů (např. bispecifické protilátky, fúzní proteiny)
• Integrované automatizaci sample-preparation a online monitoringu stability
• Další optimalizaci složení pufrů a jejich aplikaci v multidimenzionálních technikách (CE-MS, CE-LIF)

Závěr

Použití kyselého SDS vzorkovacího pufru pH 6,8 významně snižuje fragmentaci a disulfidové přeskupování u nedredukujících CE-SDS analýz protilátek. Tento jednoduchý krok vede k robustnějšímu a spolehlivějšímu vyhodnocení velikostních variant, což usnadňuje rozhodování při vývoji a kontrole kvality biologických léčiv.

Reference

1. Good D., Cummins-Bitz S., Fields R., Nunnally B. Methods in Molecular Biology, vol. 276: Capillary Electrophoresis of Proteins and Peptides, Humana Press Inc., Totowa, NJ.
2. Salas-Solano O., Tomlinson B., Du S., Parker M. et al.; Anal. Chem. 2006, 78, 6583–6594.
3. Rustandi R., Washabaugh M., Wang Y.; Electrophoresis. 2008, 29, 3612–3620.
4. Dada O., Rao R., Jones N., Jaya N., Salas-Solano O.; Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 145 (2017) 91–97.
5. Zhang J., Burman S., Gunturi S., Foley J.; Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 53 (2010) 1236–1243.
6. Leer H.; Journal of Immunological Methods. 234 (2000) 71–81.
7. Wang S., Liu A., Yan Y., Daly T., Li N.; Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 154 (2018) 468–475.