Novel structure-based profiling and annotation workflow—high-throughput analysis of flavonoids using the Thermo Scientific Orbitrap ID-X Tribrid MS

Význam tématu

Flavonoidy představují rozsáhlou třídu rostlinných polyfenolů s různorodými strukturálními modifikacemi (hydroxylace, glykozylace, acylace aj.), které ovlivňují jejich antioxidační a protizánětlivé vlastnosti. Jejich důkladná charakterizace je klíčová pro výzkum potravinářských produktů, farmacie a postupů kvality v potravinách.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři představují novou workflow pro vysokoobjemovou analýzu flavonoidů v ovocných a zeleninových šťávách. Cílem je zrychlit a zpřesnit identifikaci neznámých flavonoidů pomocí vícestupňové (MSn) spektrometrie na Orbitrap ID-X Tribrid MS a automatizovaného vyhodnocení fragmentačních dat.

Použitá instrumentace

• UHPLC Thermo Scientific Vanquish s kolonkou Hypersil Gold (2,1 × 150 mm, 1,9 µm)
• Orbitrap ID-X Tribrid MS s ESI zdrojem (HCD a CID fragmentace)
• Software Mass Frontier 8.0 pro spektrální vyhledávání
• Compound Discoverer 3.0 pro databázové vyhodnocení a FISh skóre

Použitá metodika

Vzorky (rázové šťávy Kale Blazer, Berries Gomega, Red Rhapsody) byly filtrované a 1:2 ředěné metanolem. Chromatografie probíhala ve 30min gradientu (0,1 % kyseliny ve vodě vs. methanolu) při 200 µL/min a 45 °C. Spektrální data sbíral cyklus 1,2 s: FT-MS (150–420 m/z) pro kvantitaci, následovaný řízenou MSn akvizicí (420–1200 m/z) s nepřerušeným sledováním neutrálních ztrát sacharidů až do MS4.

Hlavní výsledky a diskuse

Workflow poskytlo dvakrát vyšší pokrytí flavonoidů ve srovnání se standardní MS2 metodou:

• Identifikace rutinových metabolit, isorhamnetinu a dalších glykokonjugátů, které MS2 samostatně neodhalilo.
• Automatizované vyhledání fragmentačních podstromů v knihovně mzCloud (exact match a subtree match) pro sub­strukturální anotaci i u neexistujících referencí.
• FISh skórování v Compound Discoverer 3.0 umožnilo správné přiřazení izomerů (např. narirutin 4’-glukosid).
• Současná kvantifikace zajišťuje dostatek datových bodů pro statistické analýzy (HCA, PCA), které jednotlivé šťávy jasně separovaly.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a robustní annotace komplexních flavonoidových profilů bez potřeby manuální interpretace.
• Využití v potravinářské kontrole kvality, studiu biologické aktivity a vývoji nových potravinových doplňků.
• Integrace kvantitativních dat a strukturální identifikace v jednom měření šetří čas a náklady.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření workflow na další třídy sekundárních metabolit (steroidy, endokanabinoidy).
• Prohloubení spektrálních knihoven a automatizace subtree search pro vyšší míru pokrytí.
• Uplatnění v metabalomických studiích a klinických analýzách pro rychlou biomarkerovou identifikaci.
• Integrace s umělou inteligencí pro predikci fragmentace a strukturální anotaci v reálném čase.

Závěr

Strukturálně založený MSn přístup na Orbitrap ID-X s automatizovaným zpracováním v Mass Frontier 8.0 a Compound Discoverer 3.0 významně rozšiřuje schopnost odhalit a anotovat flavonoidy v komplexních matricích. Tento přístup kombinuje vysokou přesnost kvantifikace s hlubokou strukturální informací, čímž nabízí silný nástroj pro výzkum a průmyslovou analýzu.

Reference

1. http://metabolomics.jp/wiki/Category:FL
2. Kachlicki P., Piasecka A., Stobiecki M., Marczak L. Structural Characterization of Flavonoid Glycoconjugates and Their Derivatives with Mass Spectrometric Techniques. Molecules. 2016;21:1494.
3. Tsimogiannis D., Samiotaki M., Panayotou G., Oreopoulou V. Characterization of Flavonoid Subgroups and Hydroxy Substitution by HPLC-MS/MS. Molecules. 2007;12:593–606.
4. van der Hooft J.J.J., Vervoort J., Bino R.J., Beekwilder J., de Vos R.C.H. Polyphenol Identification Based on Systematic and Robust High-Resolution Accurate Mass Spectrometry Fragmentation. Anal. Chem. 2011;83:409–416.
5. Arita M., Suwa K. Search Extension Transforms Wiki into a Relational System: A Case for Flavonoid Metabolite Database. BioData Mining. 2008;1:7.