Digitizing the Proteomes From Big Tissue Biobanks

Význam tématu

Biobanky s formaldehydem fixovanými a parafinem zalitými (FFPE) tkáňovými vzorky představují zásadní zdroj pro objasnění molekulárních mechanismů zdraví a onemocnění. Kvantitativní proteomika tisíců proteinů napříč rozsáhlými koherentními soubory vzorků umožňuje odhalit nové diagnostické, prognostické či terapeutické biomarkery. Metoda SWATH® Acquisition spojená s vysokou propustností microflow chromatografie a pokročilým softwarovým zpracováním pak otevírá cestu k průmyslově využitelné, robustní a vysoce reprodukovatelné analýze biobankových repertoárů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat, že metodika mikroflow SWATH® Acquisition dokáže za pět dní zpracovat přes sto FFPE vzorků kolorektální tkáně s vysokou hloubkou a kvalitou kvantifikace proteomu. Studie zahrnovala 95 vzorků nádoru rekta a kolonu a 10 kontrolních zdravých vzorků. Klíčové úlohy byly:

• Optimalizovat reprodukovatelnou přípravu FFPE vzorků
• Zavést microflow LC-MS/MS workflow s vysokou propustností
• Vygenerovat a použít kvalitní spektrální knihovnu pro SWATH® Acquisition
• Analyzovat rozdíly v proteomových profilech zdravých a nádorových tkání
• Identifikovat proteomické podtypy kolorektálního karcinomu

Použitá metodika

Vzorky byly z veřejné biobanky klasifikovány patologem jako zdravé nebo nemocné. Z 10µm FFPE řezu se extrahoval protein podle upraveného protokolu s následnou tryptickou digestí a přidáním iRT standardů pro normalizaci retenční doby. Chromatograficky bylo použito 6µg digestu na běh s 43min gradientem na kolonce C18 (150×0,3 mm) při průtoku 5µL/min. Akvizice probíhala v režimu SWATH® s 120 variabilními okny, 18 ms akumulacemi fragmentů a celkovým cyklem 2,4 s vedoucím k ~6 datovým bodům na chromatografický vrchol. Celkem bylo analyzováno 105 vzorků za méně než 5 dní.

Použitá instrumentace

• Kapalinová chromatografie: NanoLC™ 425 (SCIEX) se sloupcem Triart C18, 150×0,3 mm, 5µL/min
• Hmotnostní spektrometrie: TripleTOF® 6600 (SCIEX) s Turbo V™ Source a mikroflow hybridními elektrodami
• Software pro zpracování: Spectronaut Pulsar (Biognosys) pro identifikaci a kvantifikaci SWATH® dat

Hlavní výsledky a diskuse

Reprodukovatelnost přípravy vzorků byla vysoká (průměrný peptide yield ~140µg, CV ~10 %). Retenční časy fragmentů měly medián RSD 0,4 %, což zajistilo stabilní cílenou extrakci signálů. Spektrální knihovna obsahovala 5 499 proteinových skupin a 49 176 prekurzorů. V datasetu bylo celkem kvantifikováno 4 565 proteinových skupin. Statistickou analýzou (t-test, q<0,01) bylo identifikováno 1 023 proteinů s výrazně odlišnou abundancí mezi nádorem a zdravou tkání, přičemž 703 proteinů bylo up-regulováno v karcinomu. PCA analýza zřetelně oddělila oba soubory vzorků.

Gene ontology analýza u protilátorů zvýšených v karcinomu odhalila obohacení procesů souvisejících s iniciací translace, ribozomálními funkcemi a RNA metabolizmem, což koresponduje se zvýšenou syntézou bílkovin v nádorových buňkách. Klastrací proteomických profilů karcinomových vzorků se objevily tři podtypy (A, B, C). Podtyp B vykazoval navýšenou expresi faktoru HNF4α, což souhlasí s dřívějšími výsledky pro diferenciaci subtypů.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow mikroflow SWATH® zajišťuje:

• Vysokou propustnost (24 vzorků/den) a úplnou analýzu 105 vzorků za ~5 dní
• Analytickou hloubku >4 500 proteomových skupin
• Robustní a reprodukovatelné měření bez nutnosti nanoflow
• Rychlé zpracování dat a širší standardizaci v aplikacích QA/QC a klinické proteomice

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj mikroflow technologií a modulárních SWATH® protokolů pro vyšší propustnost a integraci s multi-omickými daty. Kombinace dat z biobank s klinickými informacemi a AI-based analýzou povede k personalizované medicíně, predikci onkologického průběhu a rozšíření metodiky na další typy tkání a patologických stavů.

Závěr

Studie demonstruje, že mikroflow SWATH® Acquisition na systému TripleTOF® 6600 poskytuje průmyslově použitelný, robustní a vysoce reprodukovatelný přístup k analýze rozsáhlých biobankových kolekcí FFPE vzorků. Metoda umožňuje hlubokou proteomovou charakterizaci, identifikaci biologicky významných odlišností a detekci proteomických subtypů karcinomu.

Reference

1. Collins BC, Hunter CL, Liu Y, et al. Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry. Nature Communications. 2017;8.
2. SCIEX. Microflow SWATH Acquisition for Industrialized Quantitative Proteomics. RUO-MKT-02-3637-B.
3. Buczak K, et al. Spatial Tissue Proteomics Quantifies Inter- and Intratumor Heterogeneity in Hepatocellular Carcinoma. Molecular & Cellular Proteomics. 2018;17(4):810–825.
4. American Cancer Society. Cancer Facts & Figures 2018.
5. White-Gilbertson S, et al. The role of protein synthesis in cell cycling and cancer. Molecular Oncology. 2009;3(5-6):402–408.
6. Paschos KA, et al. The role of cell adhesion molecules in the progression of colorectal cancer and the development of liver metastasis. Cell Signalling. 2009;21(5):665–674.
7. Zhang B, et al. Proteogenomic characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 2014;513(7518):382–387.