Analysis of Free Inositol Stereoisomers in Dietary Supplements by HILIC-CAD: Detection Optimization and Analytical Performance Evaluation

Význam tématu

Inositolové stereoisomery (např. myo‑, D‑chiro‑, scyllo‑, allo‑ atd.) mají biologickou aktivitu a užívají se v potravinových doplňcích pro podporu metabolického a hormonálního zdraví. Analytická stanovení těchto sacharidů jsou náročná kvůli jejich strukturní podobnosti a absenci UV chromoforů. Studie zkoumá použití hydrofobně‑interakční chromatografie (HILIC) v kombinaci s detekcí nabitými aerosolovými částicemi (CAD) jako efektivní, cenově dostupnou alternativu k MS pro kvantitativní analýzu UV‑transparentních inositolů v doplňcích stravy.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavní cíle studie byly:

• optimalizovat provozní parametry Waters CAD (nebulizační tlak, iontová past, teplota evaporátoru) pro maximální poměr signál/šum (S/N),
• vyhodnotit vhodný kalibrační model pro nerovnoměrnou odpověď CAD,
• ověřit analytický výkon metody (lineárnost, citlivost, přesnost, správnost) a aplikovat ji na komerční doplňky stravy.

Použitá metodika a instrumentace

Chromatografická separace:

• Kolona: ACQUITY UPLC BEH Amide, 1.7 µm, 2.1 × 150 mm.
• Teplota kolony: 25 °C; průtok: 0,35 mL/min; injekční objem: 2 µL; doba analýzy: 23 min.
• Mobilní fáze A: ACN:Voda 90:10 (v/v) + 0,01 % NH4OH. Mobilní fáze B: ACN:Voda 50:50 (v/v) + 0,01 % NH4OH. Ammonium bicarbonate byl testován, ale z finální metody vyřazen kvůli snížení S/N.

Detekce a systém:

• Systém: Arc Premier System (QSM‑R, FTN‑R, CM‑A) řízený Empower CDS.
• Detektor: Waters Charged Aerosol Detector (CAD).
• Nastavené parametry CAD (optimalizace): nebulační plyn 40 psi, iontová past (ion trap) 600 V, teplota evaporátoru 95 °C, power function 1.00, vzorkovací rychlost 10 pts/s, filter time constant Normal (0,2 s).

Standarty a příprava vzorků:

• Standardy: jednotlivé roztoky inositolů (myo, D‑chiro, allo, epi, scyllo, muco, neo) v čisté vodě; pracovní rozsahy 15–600 mg/L, mix stanovení 1500 mg/L zásobně.
• Vzorky: komerční kapslové doplňky – rozpuštěny ve vodě, filtrovány 0,45 µm PVDF; přepočty/další ředění podle obsahu myo‑inositolu.
• Spiking pro ověření správnosti: dva úrovně (odpovídající označené hodnotě D‑chiro a myo).

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace CAD:

• Z testovaných parametrů měl největší vliv na S/N iontová past — zvýšení z 20 V na 600 V přineslo až ~1,5× zlepšení S/N. Nebulizační tlak měl druhý největší efekt (lepší S/N při 40 psi oproti vyšším tlakům). Evaporátorová teplota byla analyticky závislá, ale průměrně byla optimální při 95 °C.
• Přidání NH4HCO3 do mobilní fáze vedlo ke zhoršení S/N; 0,01 % NH4OH se ukázalo jako nezbytné pro stabilní retenční časy, proto byl finalizován mobilní fáze bez karbonátového aditiva.

Kalibrace a citlivost:

• CAD vykazuje inherentní nelineární odezvu; porovnány byly power‑law a druhého řádu polynomické modely. Druhý řád poskytl lepší fit (vyšší R2 a nižší relativní chyby), proto byl použit pro kvantifikaci myo‑ a D‑chiro‑inositolu.
• Lineární charakteristika (vyjádřená jako coefficient of determination) byla velmi dobrá – R2 ≥ 0,995 pro analyty v pracovních rozsazích až do ~600 mg/L.
• Odvozené LOQ se pohybovaly mezi ~17–21 mg/L (S/N = 10 interpolací).

Přesnost a správnost:

• Spiking: většina výsledků (34/36) měla procento recovery v rozmezí 90–110 %; obecně dobrá správnost (většina 96–110 % při vyšším spike).
• Opakovatelnost (intra‑day, n=3) RSD ≤ 3,6 %; mezi‑denní (n=6) RSD typicky ≤ 4,6 % s výjimkou měření D‑chiro‑inositolu v jednom vzorku, kde nízká koncentrace blízká LOQ zvýšila RSD na 7,2 %.

Analýza komerčních vzorků:

• Myo‑inositol ve čtyřech testovaných produktech odpovídal deklarovaným hodnotám v rozsahu 99–109 % (dobrá shoda s označením).
• D‑chiro‑inositol vykazoval značné rozptyly: dva produkty byly v pořádku (≈108–117 %), jeden produkt neobsahoval detekovatelný D‑chiro‑inositol a u jednoho produktu bylo nalezeno pouze ~35 % deklarovaného množství, což poukazuje na možné nedostatky v řízení kvality u výrobců.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda HILIC‑CAD poskytuje robustní, cenově dostupnou a uživatelsky příjemnou alternativu k MS pro rutinní QC stanovení UV‑transparentních inositolů v doplňcích stravy. Výhody:

• Kompatibilita s gradientními elucemi a široká univerzálnost pro ne‑ nebo málo‑volatilní analyty.
• Možnost optimalizace citlivosti díky nastavitelné iontové pasti v CAD.
• Dostatečná citlivost pro běžné úrovně obsahu v doplňcích (LOQ 17–21 mg/L) a akceptovatelná přesnost a preciznost pro QA/QC.

Omezení a provozní poznámky:

• CAD není kompatibilní s použitím non‑volatile aditiv v mobilní fázi; volba aditiv může výrazně ovlivnit S/N.
• Nezbytnost optimalizace pilířových parametrů (tlak, iontová past, teplota) pro konkrétní analytické matice; aerosolová detekce obecně podléhá větší variabilitě než UV/fluorescence.

Budoucí trendy a možnosti využití

Potenciální rozvoj a aplikace metody:

• propojení CAD s jinými detekčními technikami (např. paralelní MS) pro zlepšení selektivity a potvrzení identity,
• rozšíření validace na širší škálu matic (potraviny, suroviny, biologické vzorky),
• vylepšení kalibračních modelů a softwarových nástrojů pro automatizované nelineární kalibrace a lepší odhad nejistot,
• hardwarové inovace CAD (lepší stabilita iontové pasti, optimalizace nebulizace) pro snížení variability a zvýšení citlivosti,
• implementace metody do rutinních QC workflow v průmyslu doplňků a potravinářství pro kontrolu shody deklarovaných složek.

Závěr

Vývoj HILIC metody s CAD detekcí pro inositolové stereoisomery vykázal vynikající analytické vlastnosti pro rutinní stanovení v doplňcích stravy. Optimalizace CAD parametrů, zejména iontové pasti, zásadně zlepšila S/N a citlivost. Druhého řádu polynomický model kalibrace poskytl lepší popis nelineární odezvy CAD než tradiční power‑law. Metoda prokázala dobré hodnoty R2, LOQ 17–21 mg/L, přesnost a přesnost odpovídající požadavkům QC a byla úspěšně aplikována na komerční produkty, kde odhalila nekonzistence v obsahu D‑chiro‑inositolu u některých výrobců.

Reference

1. Yang J.; Harden S.; Rainville P. Analysis of Free Inositol Stereoisomers in Dietary Supplements by Hydrophilic Liquid Chromatography using the Arc Premier System and ACQUITY QDa II Mass Detector. Waters Application Note. 2025.
2. Yang J.; Harden S.; Rainville P. HILIC‑MS/MS Analysis of Free Inositol Stereoisomers in Foods. Waters Application Note. 2026.
3. Gorecki T.; Lynen F.; Szucs R.; Sandra P. Universal Response in Liquid Chromatography Using Charged Aerosol Detection. Anal. Chem. 2006, 78, 3186–3192.
4. Ahmad I. a. H.; et al. Charged aerosol detection in early and late‑stage pharmaceutical development: selection of regression models at optimum power function value. J. Chromatogr. A. 2021, 1641, 461997.
5. Márquez‑Sillero I.; Cárdenas S.; Valcárcel M. Comparison of two evaporative universal detectors for the determination of sugars in food samples by liquid chromatography. Microchemical Journal. 2013, 110, 629–635.