HRMS QTOF-PRM (Parallel reaction Monitoring) for ultra-trace level quantification of N-Nitroso Moxifloxacin in API and Formulations.

Význam tématu

Analýza nitrosaminních nečistot v léčivých přípravcích je kritická z hlediska bezpečnosti pacienta a souladu s regulačními požadavky. N‑Nitrosomoxifloxacin (N‑MOX) je možné genotoxické/carcinogenní impurity spojené s moxifloxacinem, pro které jsou stanoveny přísné limity příjmu (CPCA kategorie 4, AI 1500 ng/den). Metody schopné kvantifikovat N‑MOX na ultra‑stopových úrovních v API, placebu a finálních formulacích jsou tedy nezbytné pro kontrolu kvality a schvalování léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit workflow pro ultra‑trace kvantifikaci N‑nitrosomoxifloxacinu využívající vysokorozlišovací Q‑TOF ve vysoce selektivním PRM (Parallel Reaction Monitoring) režimu. Metoda měla být přenosná z TQ‑MRM, robustní vůči matricovým interferencím a splňovat regulační limity (cílová koncentrace odpovídající AI = ~5,63 ng/mL v testovacím roztoku).

Použitá metodika a instrumentace

Postup vzorkování a přípravy:

• Tablety: pět tablet moxifloxacinu bylo zváženo pro určení průměrné hmotnosti; tablety byly rozemlety a homogenizovány.
• API a placebo: připraveny spikeované vzorky simulující finální matrici.
• Testovací roztok: cílová koncentrace API 1,5 mg/mL (pro 1 mL roztoku 2,74 mg prášku tablety).
• Regulační prahová koncentrace N‑MOX odpovídající AI pro 400 mg tabletu: 5,63 ng/mL v testovacím roztoku.

Analytická strategie a přenos metody:

• Optimalizace MRM přechodů, kolizní energie (CE) a fragmentačního napětí (FragV) na triple kvadrupólu.
• Přenos parametrů na Q‑TOF PRM: průměrování CE a FragV napříč přechody pro dosažení konzistentní fragmentace.
• Plné vysokorozlišovací MS/MS spektrum pro každý prekurzor umožňující přesnohmotnostní kvantifikaci a potvrzení fragmentů.

Použitá instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity III LC (kapalinová chromatografie).
• Agilent Revident LC/Q‑TOF s ESI ionizací (pozitivní režim) pracující v PRM režimu.
• Monitored PRM přechod pro N‑MOX: m/z 431.1725 → 301.1.

Hlavní výsledky a diskuse

Citlivost a linearita:

• Metoda dosáhla dolní meze kvantifikace (LLOQ) 12,2 pg/mL a horní meze kvantifikace (ULOQ) 25 ng/mL, tedy citlivosti hluboko pod regulačním limitem 5,63 ng/mL.
• Lineární rozsah byl velmi široký s R² = 0,9997 (vážená lineární regrese 1/x), což potvrzuje vhodnost pro kvantifikaci v širokém dynamickém rozsahu.

Selektivita a přesnost:

• Monitored přechod 431.1725 → 301.1 v PRM dal vysokou selektivitu bez pozorovaných interferencí z API ani matricových komponent.
• Kombinace vysokého rozlišení a přesné hmotnosti umožnila eliminovat falešně pozitivní signály a potvrdit identitu pomocí full MS/MS spekter.

Reprodukovatelnost a recovery:

• Kontrolní vzorky (QC) při hladině 3,125 ng/mL vykázaly nízkou variabilitu, například CV ~1,17 % pro opakovatelnost signálu.
• Obnovení při spike studiích a přesnost splňovaly očekávané běžné limity pro analýzy stopových nečistot (tabulky lineárnosti a recovery shrnuty textově).

Chromatografie:

• Dobrá chromatografická separace moxifloxacinu a N‑MOX zamezila crosstalku, což podpořilo spolehlivost kvantifikací v komplexních matricích.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda Q‑TOF PRM poskytuje kombinaci citlivosti a selektivity vhodnou pro regulačně náročné analýzy nitrosaminů v API a finálních formulacích. Praktické výhody:

• Schopnost kvantifikovat N‑MOX na úrovních řádově nižších než regulační limity, umožňující jistotu při rozhodování o uvolnění šarže.
• Přesnohmotnostní potvrzení fragmentů snižuje riziko falešně pozitivních výsledků a zmírňuje potřebu dodatečných potvrzujících testů.
• Procedura přenosu z TQ‑MRM usnadňuje adaptaci stávajících metod na HRMS platformy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry dalšího rozvoje a aplikace metody:

• Rozšíření workflow na další nitrosaminové a NDSRI nečistoty s obdobným přístupem přenosu MRM parametrů do PRM režimu.
• Integrace vysoce rozlišovací MS/MS s automatizovanou validací identity (ion ratio, přesné m/z) pro rychlejší rutinní screening.
• Optimalizace přípravy vzorků a obohacovacích kroků pro ještě nižší limity detekce v náročných matricích.
• Uplatnění metody v regulacích a stability studiích pro dlouhodobý monitoring nitrosaminů v léčivech.

Závěr

Studie prokázala, že PRM na Agilent Revident LC/Q‑TOF je robustní a regulačně orientovaná platforma pro ultra‑trace kvantifikaci N‑nitrosomoxifloxacinu v API, placebu a tabletkách. Metoda nabízí vynikající linearitu, vysokou citlivost (LLOQ 12,2 pg/mL), nízkou variabilitu a selektivitu umožňující spolehlivé rozhodování o shodě s limitními hodnotami CPCA. Přenositelnost z TQ‑MRM na Q‑TOF zjednodušuje implementaci v laboratořích, které požadují přesnohmotnostní potvrzení identity nečistot.

Reference

1. Balfour JA, Wiseman LR. Moxifloxacin. Drugs. 1999 Mar;57(3):363-73; discussion 374. doi:10.2165/00003495-199957030-00007.
2. Nakka S, et al. A facile and eco-friendly simultaneous quantification LC-TQMS/MS approach for N-Nitroso Moxifloxacin and di-nitroso pyrrolopiperidine in Moxifloxacin tablets and eye drops. Green Analytical Chemistry. 2025;12:100188.
3. FDA guidance document: Recommended acceptable intake limit for NDSRIs (guidance for industry). August 2023.
4. EMA. Nitrosamine impurities: guidance for marketing authorization holders. EMA guidance on nitrosamine impurities.