Separation of a GLP-1 Receptor Agonist and Structurally Similar Impurities Using BioResolve™ Peptide Phenyl‑Hexyl+ and C18 + Columns

Význam tématu

Separation and accurate characterization of peptide-based biotherapeutik, jako je tirzepatid (agonista receptoru GLP-1), jsou pro zajištění kvality, bezpečnosti a stability klíčové. Peptidové léky bývají citlivé na chemické a enzymatické modifikace (deamidace, izomerizace, substituce aminokyselin, D-enantiomery), které často vytvářejí varianty s velmi podobnými fyzikálně-chemickými vlastnostmi. Schopnost rozlišit tyto blízce příbuzné impurity je nezbytná pro vývoj analytických metod v rámci výzkumu, vývoje a QC v biopharmaceutickém průmyslu.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentovaného Application Brief bylo demonstrovat možnost separace tirzepatidu a sedmi známých strukturálně příbuzných nečistot pomocí dvou reverzně-fázových kolonek BioResolve určených pro peptidy: Phenyl-Hexyl+ a C18+. Studie porovnává selektivitu těchto dvou stacionárních fází a zkoumá vliv délky kolony (150 vs. 300 mm) na rozlišení náročných párů špiček.

Použitá metodika

• Vzorek: tirzepatid s přidanými sedmi známými nečistotami (včetně deamidací, izomeru D-Ser32 a substituce Ile→Norvaline).
• Kolony: BioResolve Peptide Phenyl-Hexyl+ a BioResolve Peptide C18+; částice 1.6 µm; rozměry testované: 2.1 × 150 mm a 2.1 × 300 mm.
• Stavba částic: povrch s řízeným kladným nábojem a póry ~230 Å pro lepší přístup velkých peptidů.
• Mobilní fáze: A = 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě; B = 0,1 % kyseliny mravenčí v acetonitrilu.
• Gradienty: pomalé, měřené v rozsahu ~30–90 minut (příklady gradientů: 32→36 %B/90 min; 35→39 %B/30 min); pro 300 mm se použil strmější gradient při stejném běhu časově.
• Průtok: 0,3 mL/min; teplota kolony: 50 °C; detekce: UV 214 nm.
• Tlak: u 150 mm ~6 320 psi; u 300 mm ~12 150 psi (bez zohlednění tlaku systému).
• Poznámka: Jedná se o aplikační brief bez detailní experimentální sekce; parametry vycházejí z prezentovaných chromatogramů a popisu.

Použitá instrumentace

• Kolony: Waters BioResolve Peptide Phenyl-Hexyl+ a BioResolve Peptide C18+ (Superficially porous particles, 230 Å).
• Hardwarová úprava: MaxPeak Premier inertní povrchy (minimalizace nespecifické adsorpce a zlepšení obnovitelnosti a robustnosti analýzy).
• Detekce: UV detektor (214 nm). Automata a konkrétní model UHPLC nejsou v briefu specifikována.

Hlavní výsledky a diskuse

• Obě stacionární fáze dokázaly oddělit tirzepatid od několika strukturálně příbuzných impurit; to potvrzuje vhodnost BioResolve peptidových kolon pro velké GLP-1 peptidy.
• Oddělení izomeru D-Ser32 (Impurity 7) od hlavního píku bylo dosaženo na obou typech kolon, což ukazuje zachycení stereochemických rozdílů u velkých peptidů.
• Selektivita se liší mezi kemistry: na Phenyl-Hexyl+ byla Impurity 3 separována od Impurity 1 a 2, zatímco na C18+ byla oddělena Impurity 2 od 1 a 3. To ilustruje komplementární selektivitu a praktickou výhodu testování více fází při vývoji metod.
• Některé blízké varianty zůstaly na kratší kolóně 150 mm obtížně separovatelné: konkrétně Impurity 6 (Ile→Norvaline) nebyla plně oddělena od hlavního píku; tři deamidované formy nebyly na 150 mm zcela baseline separovány.
• Prodloužení kolony na 300 mm zlepšilo rozlišení při stejném době běhu i při strmějším gradientu; částečně oddělilo Impurity 1 a 2 a zlepšilo rozlišení špiček okolních hlavního píku (Impurity 6 a 7). Autoři konstatují, že navýšení délky kolony může mít často větší vliv na rozdělení než jen prodloužení gradientu na kratší koloně.
• Řízený kladný povrch částic a inertní povrchy hardware přispívají ke zlepšenému tvaru špiček a vyšší kapacitě pro bazické analyty, což je důležité při použití kyselých (formiátových) mobilních fází.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda ukazuje průkaznou cestu pro QC a vývoj metod zaměřených na rozlišení náročných peptidových variant u GLP-1 léků.
• Komplementární volba stacionárních fází (Phenyl-Hexyl+ vs. C18+) umožňuje cíleně měnit selektivitu a řešit specifické páry blízce příbuzných impurit.
• Pro zlepšení rozlišení doporučeno zvážit delší kolony (300 mm) nebo kombinaci delší délky se šetrnějšími gradienty; v případě potřeby lze optimalizovat i teplotu, pH a složení organické fáze.
• Minimální nespecifická adsorpce a upravený povrch zvyšují reprodukovatelnost a návratnost peptidů, což zlepšuje spolehlivost analytiky v běžných laboratorních pracovních postupech.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Propojení těchto separací s hmotnostní spektrometrií (LC–MS/MS) pro strukturální potvzení a kvantifikaci post-translačních modifikací a izomerů.
• Vícedimenzionální separace (např. kombinace ion-exchange/ RP nebo multidimenzionální LC) pro zvýšení informační hodnoty o kvaziizobarických variantách.
• Další vývoj stacionárních fází s cílenou chemickou interakcí pro lepší rozlišení specifických modifikací (např. aromatické nebo hydrofobní rozlišování).
• Automatizace a využití algoritmů pro optimalizaci gradientů a délky kolony s cílem zkrátit dobu vývoje metod a zvýšit robustnost v QC prostředí.
• Rostoucí tlak regulátorů na hloubkovou charakterizaci impurit bude dále posilovat význam vysoce selektivních peptidových kolon a metod.

Závěr

BioResolve Peptide Phenyl-Hexyl+ a C18+ kolonky prokázaly schopnost rozlišit tirzepatid od jeho blízce příbuzných impurit a nabídly komplementární selektivitu, která je užitečná při vývoji analytických postupů. Zvýšení délky kolony (300 mm) významně zlepšilo rozlišení některých kritických párů špiček ve srovnání s krátkou 150 mm variantou. Kombinace vhodné stacionární fáze, povrchové úpravy částic a inertního hardware představuje praktický přístup pro robustní analýzu peptidových léků v průmyslovém i výzkumném prostředí.

Reference

1. Lauber M.A.; Koza S.M.; Fountain K.J. Increasing Peak Capacity in Reversed-Phase Peptide Separations with Charged Surface Hybrid (CSH) C18 Columns. Waters Application Note. 720004568, 2013.
2. Waters Corporation. Improving Chromatographic Separations of Biopharmaceuticals with MaxPeak High Performance Surfaces (HPS) Technology. eBook. 720008110, 2024.
3. Yang H.; Warren B.; Koza S. Development of Monoclonal Antibody Charge Variant Analysis Methods Using a BioResolve SCX mAb Column. Waters Application Note. 720006477, 2019.