QUANTIFICATION OF POLYSORBATE IN MONOCLONAL ANTIBODY FORMULATIONS USING CHARGED AEROSOL DETECTION

Význam tématu

Polysorbaty (zejména polysorbate 20 a 80) jsou klíčovými nenatýkajícími povrchově aktivními látkami v bi-farmaceutických formulacích. Slouží ke stabilizaci proteinových terapeutik tím, že snižují adsorpci na povrchy a zabrání agregaci způsobené mechanickým stresem či rozhraními. Kvantifikace polysorbátů v hotových lécích je kritická pro kontrolu jakosti, avšak jejich heterogenní struktura a slabé UV-absorpční chromofory činí tradiční UV-detekci nevhodnou. Studie se zabývá robustní analytickou strategií pro přesné stanovení polysorbátů v matrici monoklonálních protilátek.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout a ověřit trap-and-elute reverzně-fázovou chromatografii (RPLC) kombinovanou s detekcí nabitými aerosoly (CAD) pro kvantifikaci PS20 a PS80 v přítomnosti proteinového matrice. Studie hodnotila konfiguraci ventilů pro minimalizaci carry-over a koeluce proteinu, optimalizovala parametry CAD (zvláště ion-trap napětí) a definovala rozsah linearity, limity kvantifikace a přesnost metody prostřednictvím spike–recovery testů s NISTmAb jako modelovou maticí.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografický přístup: trap-and-elute RPLC s Oasis MAX sorbentem pro zachycení polysorbátů a odvedení proteinové matrici do odpadu. Byl použit krátký trap-kolonn (Oasis MAX, 80Å, 30 µm, 2.1 x 20 mm).
• Konfigurace ventilů: dvojitý ventilový (double-valve) systém v column manageru sestávající ze tří kroků – (A) naložení a záchyt polysorbátů při směrování proteinů do odpadu, (B) fluid sweep pro vypláchnutí neswept objemů a tubing do odpadu, (C) eluce směrem k detektoru. Tato konfigurace snižuje residuální objem a minimalizuje koeluci proteinů.
• Detekce: Charged Aerosol Detector (CAD). Testovaly se ion-trap napětí v rozsahu 20–600 V; další nastavení CAD: sampling rate 5 Hz, time constant Normal, evaporation temp. 40 °C, PFV (power function value) použitá jako 1.0 v kalibracích.
• LC podmínky: ACQUITY Premier System; column temp. 30 °C; sample temp. 10 °C; inj. objem 30 µL; mobilní fáze A: 2.0 % formiová kyselina ve vodě, B: 2.0 % formiová kyselina v isopropanolu.
• Software: Empower LC CDS (verze 3.9.0).

Hlavní výsledky a diskuse

• Double-valve konfigurace poskytla nejkonzistentnější výkon s nejnižšími %RSD pro kalibrační standardy i spikeované vzorky. Mechanicky odstranila neswept objemy, čímž snížila pozadí a koeluci proteinů s polysorbáty.
• Optimalizace ion-trap napětí v CAD zásadně ovlivnila linearitu a stabilitu baselines. Nižší napětí (100–200 V) vykazovalo znatelnou nelinearitu a vyšší RSS; zvyšování napětí vedlo k lepší linearitě, přičemž 600 V poskytlo nejlepší R² a nejnižší RSS.
• Rozsah kalibrace pro PS20 a PS80 byl stanoven od 0.005 do 0.75 mg/mL. Pro oba surfaktanty byla pozorována vynikající linearita (R² až 0.9999). Nicméně nejnižší úrovně u PS20 vykazovaly mírně vyšší odchylky v porovnání s PS80.
• Limit kvantifikace (LOQ) byl sledován dolů do 0.005 mg/mL; při těchto velmi nízkých koncentracích se zvýšila relativní chyba u PS20, ale přesnost a přesnost (precision) zůstaly v přijatelných mezích pro vyšší úrovně.
• Spike–recovery se prováděly na NISTmAb matrici pro tři koncentrace (~0.100, ~0.300, ~0.500 mg/mL). Naměřené hodnoty byly velmi blízko očekávaným; procentuální odchylky se pohybovaly přibližně do 3 % a %RSD pod 1 % pro většinu úrovní, což potvrzuje vysokou přesnost a opakovatelnost metody.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda poskytuje citlivé, přesné a reprodukovatelné stanovení polysorbátů v přítomnosti proteinové matrice bez potřeby UV-aktivních derivatizačních kroků.
• Díky trap-and-elute přístupu a double-valve konfiguraci je snížen vliv proteinového pozadí, což umožňuje přímé měření v hotových formulacích a usnadňuje implementaci v kontrolách kvality (QA/QC) a stabilitních studiích.
• Optimalizace CAD (zejména ion-trap napětí) rozšiřuje kvantifikační dynamický rozsah a zlepšuje stabilitu základní linie, což zvyšuje spolehlivost výsledků při sledování degradace polysorbátů či jejich obsahu v finálních produktech.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zlepšení mohou plynout z kombinace CAD s orthogonalními separačními technikami (např. HILIC nebo MS-kompatibilními metodami) pro detailnější charakterizaci jednotlivých homologů a degradačních produktů polysorbátů.
• Automatizace trap-and-elute workflow a zavedení robustních referenčních materiálů umožní širší standardizaci metodiky napříč laboratořemi a průmyslem.
• Uplatnění v stability-driven studiích: metoda je vhodná pro sledování časové změny obsahu polysorbátů a identifikaci faktorů ovlivňujících degradaci (oxidace, hydrolýza), zejména pokud bude doplněna o strukturální analýzu degradantů.

Závěr

Studie prokázala, že trap-and-elute RPLC s Oasis MAX ve spojení s CAD představuje robustní, citlivý a přesný přístup pro kvantifikaci PS20 a PS80 v matici monoklonálních protilátek. Klíčovými faktory úspěchu jsou použití double-valve konfigurace ke snížení residuálních objemů a optimalizace ion-trap napětí CAD pro maximalizaci linearity a snížení šumu. Metoda nabízí vhodnou alternativu k UV nebo ELSD detekčním přístupům a je přímě použitelná v QA/QC prostředí biotechnologických výrob.

Reference

1. Martos A, et al. Trends on Analytical Characterization of Polysorbates and Their Degradation Products in Biopharmaceutical Formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2017;106(7):1722–1735.
2. Hewitt D, et al. Quantitation of Polysorbate 20 in Protein Solutions Using Mixed-Mode Chromatography and Evaporative Light Scattering Detection. Journal of Chromatography A. 2008;1215(1–2):156–160.