Improving Analytical Greenness and Analyte Recovery of HPLC Analyses Using 3 mm ID MaxPeak™ Premier Columns

Význam tématu

V současné praxi analytické chemie roste tlak na snižování environmentální stopy chromatografických metod a provozních nákladů bez zhoršení datové kvality. Změna vnitřního průměru kolony představuje praktický přístup ke snížení spotřeby organických rozpouštědel a zlepšení skóre analytické „zelenosti“ (AMGS) zejména v laboratořích, které nemohou přejít na UHPLC vybavení. Zároveň je důležité zajistit obnovu a detekovatelnost analy­tů citlivých na interakce s kovovým hardware kolony.

Cíle a přehled studie / článku

Studie porovnává výkon tří 50 mm kolón se stejnou 2,5 µm CSH C18 stacionární fází, lišících se vnitřním průměrem (4,6 mm, 3,0 mm, 2,1 mm) při použití Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert LC systému. Hlavními cíli byly:

• Porovnat chromatografickou účinnost (USP počet destiček) mezi ID kolónami.
• Vyčíslit úsporu rozpouštědel a změnu AMGS při použití menších ID.
• Ověřit inertnost MaxPeak Premier (HPS) hardware pomocí analýzy betamethasonu a betamethason‑fosfátu a porovnat jej se standardní nerezovou kolónou.

Použitá instrumentace

Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert LC System (s multicolumn thermistatem MCT a PDA detektorem). Detekce UV: 254 nm pro QCRM, 240 nm pro betamethason a jeho fosfát. Kolony testované (50 × ID mm, 2,5 µm): XSelect/XSelect Premier CSH C18 v provedeních 4,6 × 50 mm, 3,0 × 50 mm (Premier i standard), a 2,1 × 50 mm (Premier). Datový systém: Empower CDS.

Použitá metodika

Nejdříve byl změřen extra‑column volume systému metodou s nulovou kolovou spojkou a opakovanými injekcemi koffeinu; naměřená extra‑column kapacita byla 48 µL. Chromatografie QCRM byla prováděna izokraticky; použitý mobilní režim a parametry:

• Mobilní fáze A: voda + 0,1 % kyseliny mravenčí; B: acetonitril + 0,1 % kyseliny mravenčí.
• QCRM: 50:50 A:B; betamethason směs: 35:65 A:B.
• Průtoky: 2.34 mL·min⁻¹ (4,6 mm), 1.02 mL·min⁻¹ (3,0 mm), 0.50 mL·min⁻¹ (2,1 mm).
• Teplota kolony: 30 °C; teplota vzorku: 10 °C.
• Objemy injekcí pro QCRM: 4.8 µL (4,6 mm), 2.0 µL (3,0 mm), 1.0 µL (2,1 mm).

Pro výpočet AMGS byly použity parametry: technika HPLC, dva analyty, tři injekce, 1 mL objem přípravy vzorku, 1 příprava. Sekce standardy a citlivost byly ponechány prázdné.

Hlavní výsledky a diskuse

- Extra‑column objem 48 µL významně ovlivnil výkon velmi úzkých (2,1 mm) kolón na HPLC systému; standardní HPLC konfigurace tedy nevhodně podporuje 2,1 mm ID bez minimalizace extracolumn ztrát.

- Chromatografický výkon: 4,6 mm a 3,0 mm kolony dosáhly porovnatelného výkonu (podobné průměrné USP počty destiček pro naphthalen a acenaphthen). 2,1 mm kolona vykázala snížení účinnosti (~21 % ztráta pro acenaphthen vs 3,0 mm) v důsledku vyššího relativního podílu extracolumn šíření pásu.

- Spotřeba rozpouštědel: přechod z 4,6 mm na 3,0 mm snížil spotřebu rozpouštědel o 56.4 %, přechod na 2,1 mm přinesl další úspory, avšak s kompromisem v účinnosti na daném systému.

- AMGS: celkové skóre metodě se zlepšilo; konkrétně AMGS pokleslo o 43.9 % při přechodu z 4,6 mm na 3,0 mm, hlavně díky výraznému snížení „Solvent Energy Score“ (např. pokles z 32.78 na 14.80 podle použitých vstupních parametrů).

- Inertnost hardware: betamethason‑fosfát se téměř kompletně adsorboval na nerezové (stainless‑steel) kolóně a byl téměř nedetekovatelný, zatímco MaxPeak Premier kolona (HPS povrch) umožnila dobrou intenzitu signálu a tvar píku pro tento fosfátovaný steroid. To potvrzuje přínos povrchově upraveného, nízkoadsorpčního hardware pro analýzy kovově‑citlivých nebo polárně‑anionických látek.

Přínosy a praktické využití metody

• Laboratoře provozující pouze HPLC systémy mohou dosáhnout významných úspor rozpouštědel a snížení environmentální stopy bez nutnosti přechodu na UHPLC pouhou změnou ID kolony z 4,6 mm na 3,0 mm, pokud jejich extra‑column objem není příliš vysoký.
• MaxPeak Premier hardware zvyšuje obnovu a detekovatelnost kovově‑citlivých/neutrálně anionických analy­tů (např. fosfátované steroidy), čímž snižuje riziko falešně nízkých výsledků nebo ztráty sloučenin v metodách založených na běžných nerezových součástech.
• Snížení spotřeby rozpouštědel má přímý ekonomický dopad (nižší náklady) a pozitivní vliv na AMGS hodnocení používané v průmyslové praxi.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace HPLC systémů snížením extracolumn objemu (kratší/hubší vedení, minimalizace spojek) umožní spolehlivě používat i 2.1 mm ID kolony pro další snížení spotřeby rozpouštědel při zachování účinnosti.
• Širší adopce povrchově inertních hardware (např. MaxPeak HPS) v regulovaných analýzách, zejména pro farmaceutické suroviny a formulace obsahující ionizovatelné nebo kovově‑citlivé analyty.
• Integrace AMGS do rutinní validace a vývoje metod jako standardní metrika pro rozhodování mezi kompromisy výkon vs. udržitelnost.
• Další práce zaměřené na kvantifikaci dlouhodobých nákladových a ekologických benefitů přechodu na menší ID a inertní hardware v rámci rozsáhlejších laboratorních portfolií metod.

Závěr

Přechod ze 4,6 mm na 3,0 mm ID kolony s identickou 2,5 µm CSH C18 stacionární fází na běžném HPLC systému poskytuje téměř stejnou chromatografickou účinnost, přitom snižuje spotřebu organických rozpouštědel o více než 50 % a snižuje AMGS přibližně o 44 %. Kolony s 2,1 mm ID mohou nabídnout další úspory, ale vyžadují nízký extracolumn objem (tj. UHPLC‑like konfiguraci) pro zachování účinnosti. Použití inertního MaxPeak Premier hardware výrazně zlepšuje obnovu a detekci kovově‑citlivých analy­tů, což je klíčové pro spolehlivost analytických výsledků ve farmaceutickém a biologickém sektoru.

Reference

1. Hicks M.; et al. Making the Move Towards Modernized Greener Separations: Introduction of the Analytical Method Greenness Score (AMGS) Calculator. Green Chem. 2019, 21, 1816.
2. ACS Green Chemistry Institute Pharmaceutical Roundtable. AMGS Calculator. 2026.
3. Berthelette K.; Walter T.H.; DeLoffi M.; Kalwood J.; Haynes K. Creating Greener HPLC Methods as Measured by the AMGS Metric: A Case Study of Improving USP Monograph Methods. Waters Application Note, 2024.
4. Dlugasch A.; Hong P. Taking Advantage of 12k psi Pressure Capabilities for Modernizing USP Methods on the Alliance iS HPLC System. Waters Application Note, 2025.
5. Berthelette K.; Walter T.H.; Collins C.; DeLoffi M.; Haynes K. Applying Analytical Method Greenness Scoring to the USP Monograph of Naproxen. Waters Application Note, 2024.
6. Hong P.; McConville P.R. Dwell Volume and Extra‑Column Volume: What Are They and How Do They Impact Method Transfer? Waters White Paper.
7. Iraneta P.C.; Wyndham K.D.; McCabe D.R.; Walter T.H. A Review of Waters Hybrid Particle Technology. Part 3. Charged Surface Hybrid (CSH) Technology and Its Use in Liquid Chromatography. Waters White Paper.
8. Lauber M.; et al. Low Adsorption LC Technology Based on MaxPeak High Performance Surfaces. Waters White Paper.
9. Berthelette K.; Collins C.; Walter T.H. Development of a LC‑UV Method for Separating 12 Steroids using a Waters Acquity Biphenyl RP Column with MaxPeak Technology. Waters Application Note, 2026.