Two-Step Matrix Deposition for Improved MS Imaging Resolution

Význam tématu

Použití matrixu a jeho aplikace je klíčovým krokem v MALDI-based mass spectrometry imaging (MSI). Volba metody nanášení ovlivňuje velikost krystalů matrixu, prostorové rozlišení a efektivitu extrakce analyzátů. Se zvyšujícím se prostorovým rozlišením (<10 µm) je kritické dosáhnout malých a homogenních krystalů, zároveň však rostoucí rozlišení snižuje signál, protože oblast ionizace je menší. Dvouetapová („Two‑Step“) aplikace—kombinace sublimačního nanášení pro malé krystaly a následného postřiku pro lepší extrakci—cílí na kompromis mezi vysokým rozlišením a citlivostí, což má praktický význam pro biomedicínské a rostlinné MSI studie, kde jsou vyžadovány detaily prostorového rozložení metabolitů a lipidů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo porovnat čtyři způsoby aplikace matrixu (postřik, sublimační nanášení, sublimační nanášení následované rekrystalizací a dvoustupňová metoda: sublimační nanášení následované postřikem) z hlediska velikosti krystalů, signální intenzity a kvality obrazů při MSI. Experimenty byly provedeny jako důkaz konceptu na plátcích jahod při 25 µm a následně na tkáních myšíích mozků při 25 µm a 5 µm s cílem posoudit dopad na detekci metabolitů a lipidů.

Použitá metodika

Popis metodiky:

• Porovnávané podmínky: (A) postřik (spray), (B) sublimační nanášení (sublimation), (C) sublimační nanášení + rekrystalizace (recrystallize), (D) sublimační nanášení + postřik (Two‑Step).
• Vzorky: plátky jahod a řezy myšího mozku (včetně cerebella pro 5 µm snímky).
• Analýza dat: softwarově zpracování a vizualizace v IMAGEREVEAL MS; pro identifikace lipidů využity vyhledávací zdroje (např. LipidMaps) a MS/MS fragmentace.

Klíčová pozorování týkající se morfologie matrixu: sublimační aplikace vytváří malé a homogenní krystaly; postřik generuje větší a variabilnější krystaly, ale zlepšuje extrakci analyzátů; dvoustupňová metoda kombinuje výhody obou přístupů.

Použitá instrumentace

• Matrice: DHB (2,5‑dihydroxybenzoová kyselina).
• Sublimační systém: Shimadzu iMLayer.
• Postřikový systém: Shimadzu iMLayer AERO (nastavení pro postřik: 30 mg/mL DHB v 70% MeOH, 0,1% TFA; 10 vrstev při 75 mm/s).
• Spektrometrické zařízení: iMScope QT v kombinaci s LCMS‑9050 (atmosférický MALDI‑IMSI systém).
• Data acquisition: pozitivní polarita; DL teplota 250 °C; heat block 450 °C; rozsahy m/z 100–600 a 600–950; prostorové rozlišení/pitch 5 a 25 µm; nastavení laseru: průměr 0/2, intenzita 27/65, repetice 2 kHz.
• Softwarová analýza: IMAGEREVEAL MS.

Hlavní výsledky a diskuse

• Dvoustupňová aplikace zvýšila extrakci analyzátů a tím i detekovatelnost u řady sledovaných rostlinných metabolitů a mozkových lipidů. U vzorků jahod imaged při 25 µm byly intenzity některých metabolitů výrazně vyšší po Two‑Step přípravě ve srovnání se samotným sublimačním nebo postřikovým přístupem.
• Překvapivě pro MS/MS fragment Pelargonidin‑3‑O‑glucoside při 25 µm vykázala nejvyšší intenzitu data ze sublimačního nanášení, což ukazuje, že zvýšená extrakce není univerzálně lepší pro všechny iony; efekt záleží na chemické povaze analyzátu a podmínkách ionizace.
• U mozku myši byly pozorovány rozdíly v intenzitách různých lipidů vztahující se k aplikační metodě; některé lipidy byly nejsilnější po dvoustupňovém postupu, jiné po sublimačním nanášení nebo postřiku.
• Při vysokém prostorovém rozlišení (5 µm) na cerebellu dvoustupňová metoda poskytla lepší definici buněčných vrstev a detailnější obraz než ostatní způsoby přípravy, což naznačuje zlepšenou rovnováhu mezi malými krystaly a lokální citlivostí.
• Omezení: dvoustupňový postup nevede ke zlepšení pro všechny analyzáty; volba metody by měla být cíleně optimalizována podle analyzované třídy molekul a požadovaného rozlišení.

Přínosy a praktické využití metody

• Two‑Step přístup poskytuje praktickou strategii pro MSI, když je cílem vysoké prostorové rozlišení a současně adekvátní signální intenzita. To je zvláště relevantní při mapování složek s jemnou topografií v tkáních nebo rostlinných vzorcích.
• Metoda umožňuje zvýraznit vybrané anality v rámci jednoho experimentu, což může být užitečné v oborech jako farmakokinetika, neuropatologie, metabolomika rostlin a kvalitativní lokalizační studie.
• Výsledky ukazují, že kombinace sublimačního kroku pro kontrolu velikosti krystalů a následného mokrého postřiku pro extrakci je technicky proveditelná a reprodukovatelná na dostupné aparatuře Shimadzu, což usnadňuje nasazení v laboratořích používajících AP‑MALDI systémy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace parametrů Two‑Step aplikace: složení postřikového rozpouštědla, koncentrace matrixu, počet vrstev a rychlost postřiku pro různé třídy molekul.
• Automatizace a standardizace postupu pro zlepšení reprodukovatelnosti mezi laboratořemi a pro kvantitativnější přístupy.
• Integrace s pokročilými ionizačními zdroji a vysokorozlišovacími analyzátory pro zvýšení citlivosti při sub‑mikroskopickém rozlišení.
• Multimodální zobrazování kombinující MSI s optickými či imunohistochemickými daty pro přesnější biologickou interpretaci prostorového rozložení.
• Vývoj specializovaných matrixů a aditiv, které lépe kombinují malé krystaly s vysokou extrakcí, případně použití cílených derivatizačních postupů před aplikací matrixu.

Závěr

Dvoustupňová metoda nanášení matrixu (sublimace následovaná postřikem) představuje efektivní kompromis mezi požadavkem na malé homogenní krystaly pro vysoké prostorové rozlišení a potřebou dostatečné lokální extrakce analyzátů pro dosažení přijatelné citlivosti. Studie demonstrovala zlepšení detekce u většiny testovaných metabolitů a lipidů a výraznou výhodu v detailech obrazů při 5 µm pro mozkovou tkáň, přičemž zdůraznila, že vliv se liší podle konkrétní chemické třídy analyzátů. Metoda je vhodná jako cílený přístup pro projekty vyžadující vysoké rozlišení s lepšími šancemi na zachycení slabších signálů, přičemž další optimalizace může rozšířit její univerzálnost.

Reference

• Wang et al., Food Chemistry, 2021, Vol. 345, 128838.