Comprehensive Characterization and Impurity Profiling of the GLP-1 Analogue Tirzepatide Using the Xevo™ G3 QTof High Resolution Mass Spectrometer

Význam tématu

Peptidová léčiva agonistů GLP-1 (např. tirzepatid) jsou klíčová v terapii diabetu 2. typu a obezity, avšak jejich chemická složitost a náchylnost k modifikacím (oxidace, deamidace, štěpení) vyžadují robustní analytické přístupy. Forced degradation studie odhalují možné dráhy degradace, validují stabilitně indikující analytiky a zajišťují, že potenciálně klinicky relevantní nečistoty jsou identifikovány a kontrolovány. Vysoce-resolucní hmotnostní spektrometrie (HRMS) představuje zásadní nástroj pro detailní mapování peptidů, lokalizaci modifikací a podporu vývoje a kontroly kvality biotechnologických produktů.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři demonstrovali použití systému Xevo G3 QTof ve spojení s ACQUITY UPLC I-Class a softwarovou platformou UNIFI (součást waters_connect) pro komplexní charakterizaci tirzepatidu a profilování produktů vzniklých při nucené oxidační degradaci. Hlavním cílem bylo identifikovat hlavní a vedlejší produkty degradace, lokalizovat místa modifikací a ukázat schopnost workflow poskytovat vysokou přesnost hmotnosti a spolehlivé přiřazení fragmentů pro deklaraci nečistot.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Vzorek: tirzepatid referenční materiál 0,1 mg/mL ve vodě s 0,1 % kyselinou mravenčí.
• Stress test: přidání 1 % (v/v) H2O2 a inkubace při 40 °C; odběry v časech 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 9 a 12 h.
• Řízení dat: UNIFI Application s předpřipravenými workflow pro peptide mapping, automatické potvrzení hmotnosti, dekonvoluci a filtrování nečistot.

Použitá instrumentace

Hlavní přístroje a klíčová nastavení (shrnutí):

• HPLC/UPLC: Waters ACQUITY Premier UPLC I-Class s kolonou ACQUITY Premier CSH C18 Peptide (2.1 × 100 mm, 1.7 µm, 130 Å). Teplota kolony 60 °C, teplota vzorku 40 °C, injekční objem 1 µL, průtok 0.4 mL/min. Mobilní fáze: voda + 0.1 % formiové kyseliny a acetonitril + 0.1 % formiové kyseliny.
• MS: Waters Xevo G3 QTof v režimu sensitivity, pozitivní ionizace, rozsah m/z 50–2000, rychlost skenování 10 Hz. Klíčová napětí a teploty: cone ~30 V, zdroj 120 °C, desolvatace ~350 °C, kapilární napětí ~2.8 kV. MSE nastavení: nízká energie 6 V; rampované vyšší energie 30–55 V.
• Software: UNIFI Application (waters_connect) včetně BayesSpray dekonvoluce pro převod vícenásobně nabitých signálů na intaktní monoisotopické hmotnosti a integrované nástroje pro vizualizaci fragmentace a trendů během časové řady.

Hlavní výsledky a diskuse

Identifikace hlavního druhu:

• Tirzepatid byl identifikován s vynikající přesností (přibližně 0.3 ppm chyby) a potvrzením rozsáhlé sady fragmentů (57 primárních fragmentů), včetně lokalizace linkeru a C20 mastné di-kyseliny v modifikaci K20.

Profilování nečistot a časová dynamika:

• Chromatogramy ukázaly postupný pokles intenzity mateřské látky (ret. cca 15.29 min) s odpovídajícím nárůstem více degradovaných špiček během 12hodinového oxidačního testu.
• UNIFI umožnil import sekvenčních informací, návrh možných modifikací (mastné řetězce, linkery) a automatickou přiřazovací analýzu neznámých komponent.

Izomery:

• Byly rozpoznány čtyři chromatograficky separované izomerní komponenty obsahující modifikaci Linker + FA20, všechny s nízkou chybou hmotnosti (-1.4 až 1.5 ppm), což zdůrazňuje význam chromatografického rozlišení pro správné kvantitativní a kvalitativní hodnocení.

Oxidace:

• Oxidace tryptofanu byla dominantní degradací při oxidačním stresu — detekovány byly formy s jednou, dvěma a třemi oxidacemi. Tyto formy byly lokalizovány pomocí rozsáhlé sekvence b- a y-iontů a pojmenování fragmentů v UNIFI, s příkladnými chybami hmotnosti v intervalu přibližně -0.8 až -2.1 ppm a desítkami potvrzených primárních fragmentů pro každou formu.

Deamidace:

• Deamidace Q19 byla identifikována jako samostatná komponenta (ret. ~15.9 min). Její přítomnost již v časovém nultém vzorku naznačuje, že část této modifikace vznikla během skladování spíše než v rámci inkubace s peroxidem. Intenzita tohoto degradačního produktu se v průběhu oxidačního testu spíše snižovala.

Metodologické poznámky:

• BayesSpray dekonvoluce, která využívá sekvenční priori informace, poskytla čitelnější intaktní spektra než klasické MaxEnt přístupy, což zlepšilo cílenou identifikaci a čištění spektrálních výsledků.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické výhody prezentovaného workflow:

• Vysoká přesnost hmotnosti (sub-2 ppm) pro spolehlivé potvrzení složení peptidu a identifikaci modifikací.
• Integrované, přednastavené workflowy v UNIFI zrychlují screening, vizualizaci trendů a automatizují přiřazení fragmentů a modifikací, čímž šetří čas analytiků.
• Chromatografická kolona ACQUITY Premier CSH C18 Peptide poskytuje adekvátní separaci peptidových izomerů a blízkých nečistot, důležitou pro kvantifikaci a bezpečnostní hodnocení.
• Metoda je vhodná pro vývoj stabilitně indikujících analytik, forenzní identifikaci nežádoucích modifikací a porovnání generických syntetických peptidů s originálními rDNA produkty.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry a aplikační rozšíření:

• Širší integrace HRMS do rutinní kvality a uvolňování peptidových léčiv, včetně automatizovaných pipeline pro peptide mapping a reportování.
• Rozvoj lepších dekonvolučních a strojově učených algoritmů (např. vylepšený BayesSpray, AI-poháněné nástroje) pro rozlišení komplexních izomerů a nízkoúrovňových degradantů.
• Spojování SEC-MS pro monitorování agregátů s vysokomolekulárními nečistotami a jejich charakterizaci v komplexních matricích.
• Zvýšená pozornost regulatorních požadavků při rozvoji generik peptidů; potřeba robustních analytik pro porovnávání posttranslačních a chemických modifikací.
• Využití softwarové automatizace a vizualizace dat pro rychlejší rozhodování v procesu vývoje a kontroly kvality.

Závěr

Studie ukazuje, že kombinace Xevo G3 QTof, ACQUITY UPLC a UNIFI Application umožňuje komplexní charakterizaci tirzepatidu a detailní profilování oxidačních i dalších degradačních produktů. Workflow poskytuje vysokou přesnost hmotnosti, robustní přiřazení fragmentů a schopnost lokalizovat modifikace jako oxidace tryptofanu či deamidaci Q19. Tyto nástroje významně podporují vývoj stabilitně indikujících metod, kontrolu kvality a splnění regulatorních požadavků pro peptidová léčiva.

Reference

1. Alfaris N; et al. GLP-1 Single, Dual, and Triple Receptor Agonists for Treating Type 2 Diabetes and Obesity: A Narrative Review. eClinicalMedicine, Volume 75, 2024, 102782.
2. Darwish, R.; Abu-Sharia, G.; Butler, AE. History of Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Agonists, Pharmacological Research. Volume 222, 2025, 108045.
3. Rao, PP. Revolutionizing obesity treatment: The Emerging Role of Glp-1 Receptor Agonists and Next-Generation Pharmacotherapies. Obesity Medicine, Volume 60, 2026, 100686.
4. Xu, F.; Wang, KY.; Wang, N.; Li, G.; Liu, D. Bioactivity of a Modified Human Glucagon-Like Peptide-1. PLoS One. 2017;12(2):e0171601.
5. Peri, RV.; Anchan, H.; Jonnalagadda, K.; Varghese, R.; Gupta, P. Designing GLP-1 delivery: Structural Perspectives and Formulation Approaches for Optimized Therapy. Nutr Diabetes. 2025;15(1):53.
6. Zhang, T.; Liu, S.; He, S.; Shi, L.; Ma, R. Strategies to Enhance the Therapeutic Efficacy of GLP-1 Receptor Agonists through Structural Modification and Carrier Delivery. Chembiochem 2025;26(8):e202400962.
7. Jones, K. Tools and Techniques for GLP-1 Analysis. LCGC June 9, 2025.
8. Koza, MK.; Wuthrich, P.; Shiner, S.J.; Lauber, M.A. Denaturing SEC-MS Analysis of High Molecular Weight Impurities in the GLP-1a Lipopeptides Semaglutide and Tirzepatide. Waters Application Note. 2026.
9. Kim, S.H.; Kim, S.S.; Kim, H.J.; Park, E.J.; Na, .H. Peptide Mapping Analysis of Synthetic Semaglutide and Liraglutide for Generic Development of Drugs Originating From Recombinant DNA Technology. J Pharm Biomed Anal. 2025;256:116682.
10. Kuril, A.K.; Saravanan, K.; Subbappa, P.K. Analytical Considerations for Characterization of Generic Peptide Product: A regulatory insight. Analytical Biochemistry, Volume 694, 2024, 115633.
11. ICH Guidelines Q5C: Quality of Biotechnological/Biological Products: Stability Testing of Biotechnological/Biological Products.
12. ICH Guidelines Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products.
13. ICH Guidelines Q5E: Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in their manufacturing Process.
14. Nauck, M.A.; D'Alessio, D.A. Tirzepatide, A Dual Gip/Glp-1 Receptor Co-Agonist for the Treatment of Type 2 Diabetes With Unmatched Effectiveness Regarding Glycaemic Control and Body Weight Reduction. Cardiovasc Diabetol. 2022;21(1):169.
15. Gibson, K. Investigating the Structure and Physical Stability of Glp1-Like Peptides Using Mass Spectrometry. Apollo - University of Cambridge Repository; 2023.
16. Min J.S.; et al. A Comprehensive Review on the Pharmacokinetics and Drug-Drug Interactions of Approved GLP-1 Receptor Agonists and a Dual GLP-1/GIP Receptor Agonist. Drug Des Devel Ther. 2025;19:3509-3537.