Evaluation of a fully automated method for the measurement of glycerol in wine

Význam tématu

Glycerol je třetí nejhojnější chemickou složkou ve vínech a klíčovým vedlejším produktem alkoholové fermentace. Jeho koncentrace (obvykle kolem 5 g/L, lokálně až 15–20 g/L) ovlivňuje tělo, viskozitu a vnímání sladkosti vína, ačkoliv často zůstává pod hranicí přímého senzorického rozlišení. Spolehlivá kvantifikace glycerolu je proto důležitá pro řízení fermentačních procesů, kontrolu kvality a validaci analytických workflow v enologii a průmyslové výrobě vína.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyhodnotit plně automatizovanou enzymatickou metodu pro stanovení glycerolu v různých typech vína implementovanou v Thermo Scientific™ Arena™ (discrete analyzer) a porovnat její výsledky s analyzátorem WineScan™ FT120 (FOSS) a s akreditovanou enzymatickou referenční metodou prováděnou laboratoří ALKO, Inc. Studie zahrnovala 53 vzorků (17 bílých, 3 rosé, 33 červených) a pět testovacích (proficiency) vzorků analyzovaných akreditovanou metodou.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda:

• Enzymatický kolorimetrický postup založený na kaskádě enzymů: glycerokináza (GK), ADP-dependentní hexokináza (ADP-HK) a glukóza-6-fosfát-dehydrogenáza (G6P-DH). Reakční sled vede ke vzniku NADH, jehož zvýšení se měří při 340 nm.
• Provedení: 5 µL vzorku inkubováno při 37 °C s 100 µL pufru obsahujícího D-glukózu a enzymy po dobu 120 s, následně blank měření; poté přidání 25 µL reagentu s NAD+ a ATP, inkubace 420 s a měření absorbance při 340 nm.
• Měřicí rozsah: 0,07–30,00 g/L glycerolu.
• Kalibrace: dvoubodová (two-point) s dvěma replikáty pro každý kalibrátor; výsledky vypočteny lineární kalibrační rovnicí.
• Vzorky: 53 nepernaturovaných vín bez předúpravy; kontrolní roztoky připravené z čistého glycerolu ve vodné matrici ve dvou koncentracích.

Použitá instrumentace

• Arena 20XT discrete analyzer (Thermo Fisher Scientific) – primární přístroj použitý pro fotometrická měření.
• WineScan FT120 (FOSS) – použit jako komparativní zařízení.
• Metoda rovněž adaptována pro Thermo Scientific Gallery a Gallery Plus discrete analyzátory.
• Systémový reagens: Thermo Scientific Glycerol kit; kalibrátor: glycerol standard.

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky studie ukazují, že metoda prováděná na Arena 20XT poskytuje přesné, opakovatelné a srovnatelné stanovení glycerolu ve víně:

• Celkový počet analyzovaných vzorků: 53 (17 bílé, 3 rosé, 33 červené).
• Korelace: koeficient korelace mezi Arena a WineScan byl 0,964, zatímco shoda vůči akreditované enzymatické metodě ALKO byla 1,000 pro pět proficiency vzorků.
• Proficiency testy: pět testovacích vzorků analyzovaných Arenou ukázalo hodnoty blízké tolerančním intervalům udaným pro referenční metody (příklady zahrnují bílé víno 5,22 g/L vs tolerance 5,4 ± 0,8 g/L; červené 6,82 g/L vs 7,1 ± 1,1 g/L atd.).
• Opakovatelnost (within-run repeatability): stanovena na vzorcích v rozmezí 4,25–10,39 g/L; pozorované směrodatné odchylky byly mezi 0,036 a 0,099 g/L, což svědčí o dobré přesnosti opakovaných měření.

Diskuse:

• Enzymatický princip měření (vznik NADH měřený při 340 nm) je robustní a umožňuje citlivé měření v širokém rozmezí koncentrací relevantních pro enologii.
• Metoda na discret analyzátoru umožňuje plně automatizované zpracování malých objemů vzorků (5 µL) bez potřeby předúpravy, což zlepšuje průtok práce a snižuje riziko chyby při manipulaci.
• Vysoká korelace s akreditovanou metodikou potvrzuje vhodnost nasazení metody v rutinních laboratořích pro QC a monitoring fermentací.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizace a nízký odběr vzorku: metoda minimalizuje manuální zásahy, šetří materiál a zvyšuje reproducibilitu výsledků.
• Široký měřicí rozsah (0,07–30 g/L) umožňuje stanovení jak typických, tak i zvýšených hladin glycerolu bez nutnosti ředění ve většině případů.
• Rychlost a kapacita: vhodné pro rutinní analýzy ve vinařských laboratořích a v provozech s vyšším počtem vzorků; možnost multiplexování dalších testů na stejném analyzátoru.
• Kompatibilita s dalšími platformami (Gallery, Gallery Plus) zvyšuje flexibilitu při zavádění metody do různých laboratoří.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s laboratorními informačními systémy (LIMS) a automatizované workflow pro zpřesnění sledování fermentačních procesů a historie šarží.
• Rozšíření panelu metod na diskrétních analyzátorech pro simultánní stanovení dalších parametrů vína (cukry, organické kyseliny, etanol) umožní komplexní kontrolu kvality na jedné platformě.
• Další validace v různých matricích vína (silně aromatizovaná vína, perlivá vína, řezy s vyšší viskozitou) a studium interferencí (např. vysoké hladiny SO2, polysacharidy) pro upřesnění omezení metody.
• Možnost miniaturizace a přenositelné verze pro in-field monitoring fermentací a rychlé rozhodování ve výrobě.

Závěr

Plně automatizovaná enzymatická metoda Glycerol použitá na Thermo Scientific Arena 20XT prokázala vysokou přesnost, dobrou opakovatelnost a velmi dobrou shodu s akreditovanou referenční metodou. Metoda je vhodná pro rutinní měření glycerolu ve víně bez předúpravy vzorků, s širokým měřicím rozsahem a nízkým odběrem vzorku. Díky kompatibilitě s dalšími diskrétními platformami představuje praktické řešení pro laboratorní monitoring a kontrolu kvality ve vinařství.

Reference

1. Ribéreau-Gayon P., Glories Y., Maujean A., Dubourdieu D. Handbook of Enology, Volume 2: The Chemistry of Wine Stabilization and Treatments. John Wiley & Sons, New York, 2000.
2. O’Kennedy K. Glycerol: The Myth. newworldwinemaker.com, 2010. (internetový článek)
3. Patterson T. Many Roads to Mouthfeel. winesandvines.com, (internetový článek)
4. Organisation Internationale de la Vigne et du Vin (OIV). Compendium of International Methods of Wine and Must Analysis, 2009.