A Guide for Optimization of Data‑Dependent Acquisition Settings in Metabolomics

Význam tématu

Získání kvalitních MS/MS dat je klíčovým omezením v neřízené (untargeted) metabolomice, protože spolehlivá anotace metabolitů vyžaduje vysoce informativní fragmentační spektra a jejich přesné porovnání se spektrálními knihovnami. Optimalizace parametrů data‑dependent acquisition (DDA) na moderních Q‑TOF instrumentech umožňuje zvýšit pokrytí MS/MS, zlepšit kvalitu spekter a urychlit identifikaci biologicky relevantních sloučenin při zachování efektivity měření.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technického přehledu je poskytnout praktický návod pro nastavení klíčových parametrů Auto MS/MS a Directed MS/MS na Agilent Revident LC/Q‑TOF (MassHunter DA v.12.x–13.x) v kontextu HILIC metabolomického workflowu. Studie zkoumá vliv m/z rozsahu, prahu pro výběr prekurzoru, počtu prekurzorů na cyklus, rychlosti akvizice, strategií pro exclusion list a použití iterativního (worklist‑řízeného) DDA na pokrytí MS/MS a kvalitu shody s knihovnou.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorkování a příprava: extrakce plasmatu pomocí Agilent Captiva EMR SPE z 100 µL plazmy; srážení proteinů MeOH/EtOH (1:1) a následné re‑kondenzace do ACN/MeOH/voda (8:1:1) se spikováním interní směsí standardů (konečná koncentrace 6 µM ve vstřiku).
• Chromatografie: robustní HILIC metoda (23 min) na Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC‑Z, 2.1 × 150 mm, 2.7 µm; teplota kolony 15 °C; mobilní fáze A: 20 mM ammonium acetát pH 9.3 s 5 µM medronic acid; B: acetonitril; injektáž 3 µL.
• Instrumentace: Agilent Revident LC/Q‑TOF běžící s MassHunter Data Acquisition for TOF/Q‑TOF LC/MS verze 12.1 (a novější); MassHunter Qualitative Analysis v.12/13 pro vyhodnocení; interní referenční ionty purin m/z 119.03632 a HP‑921+acetát m/z 980.016375.
• MS parametrizace: negativní ESI; fragmentor 100 V; skimmer 45 V; kapilární napětí 3000 V; nozzle 500 V; tři fixní kolizní energie 10, 20 a 40 V pro generování multi‑CE spekter.
• Spektrální knihovna: interní HILIC knihovna s ~558 metabolity včetně RT a MS/MS pro 10/20/40 V, použita pro hodnocení kvality spekter.

Hlavní výsledky a diskuse

• Strategie exclusion listu výrazně ovlivňuje MS/MS pokrytí: krátký základní exclusion (pouze referenční m/z) dal pokrytí ~12 %; statický exclusion založený na blanku zvýšil pokrytí na ~29 %; použití Directed MS/MS s preferovaným seznamem přineslo ~27 %; dynamický iterativní exclusion (automaticky generovaný) dosáhl ~41 % pokrytí v jednom vstřiku u rostlinného extraktu.
• Optimalizace duty cycle: pro HILIC s průměrnou šířkou špičky ~10 s se jako dobrý výchozí bod ukázalo MS1 6 Hz, MS2 10 Hz a maximálně 3 prekurzory na cyklus (3 CE). Kalkulátor doby cyklu v MassHunter pomáhá nastavit kompromis mezi počtem bodů přes chromatografickou špičku a počtem izolovaných prekurzorů.
• Rychlost MS2 akvizice vs. kvalita spekter: zvýšení MS2 rychlosti (5 → 25 → 50 Hz) zkracuje dobu cyklu a může zvýšit pokrytí, ale snižuje počet transiéntů na spektrum a tím mizí nízkointenzní fragmenty. Průměrné Library Scores pro spikeované metabolity klesaly s rostoucí rychlostí (při Auto MS/MS: ~69 při 5 Hz, ~54 při 25 Hz, ~46 při 50 Hz). Podobný trend pozorován i pro Directed MS/MS.
• Variable acquisition rate a cílový počet iontů: nastavení variable MS2 rate a target count (doporučený target count ≥ 30 000) umožní automatické upravení počtu transiéntů podle intenzity prekurzoru; aktuální implementace má min. limit 200 transients a lze nakonfigurovat časový limit akumulace.
• Iterativní Auto MS/MS: nejvyšší celkové MS/MS pokrytí (~90 %) bylo dosaženo při opakovaných iteracích Auto MS/MS při maximální MS2 rychlosti 50 Hz po třech opakovaných vstřicích, přičemž iterativní režim snižuje nutnou manuální práci při tvorbě exclusion listů.

Přínosy a praktické využití metody

• Praktické doporučení pro neřízené metabolomické studie: nastavit MS1 ~6 Hz, používat 3 CE (10/20/40 V) a začít s 3 prekurzory/cyklus; povolit active exclusion s časem uvolnění ~1/3–1/2 šířky špičky; použít iterativní workflow pro maximální pokrytí.
• Data storage a převod: doporučeno nastavit profile threshold na 0 a nízké centroid prahy (v tomto projektu relativní centroid threshold 1×10−4 %; absolutní centroid thresholds: MS1 = 100, MS/MS = 5) a ukládat „both“ (profile + centroid) při použití SureMass převodu.
• Purity a izolace: úzká kvadrupólová šířka (~1.3 m/z), purity stringency 100 % a cutoff ~30 % minimalizují chimerická spektra; přitom kompromis mezi čistotou a počtem získaných spekter musí být zohledněn v závislosti na cílech studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozvoj inteligentních pracovních postupů (worklist‑driven iterative DDA) bude nadále zvyšovat automatizaci tvorby exclusion/preferred listů a snižovat manuální zásahy v nestrukturovaných studiích.
• Pokročilé algoritmy pro řízení variabilní akvizice (adaptive MS2 rate based on precursor characteristics) a lepší cílení na statisticky významné funkce (předběžná MS1 analýza a ANOVA/fold‑change řízení Directed MS/MS) zlepší poměr mezi pokrytím a kvalitou spekter.
• Integrace rozsáhlejších a kvalitnějších spektrálních knihoven spolu s nástroji pro hodnocení čistoty (purity scoring) sníží počet falešných anotací a urychlí confident identification v metabolomice.

Závěr

Optimalizace DDA parametrů na Agilent Revident LC/Q‑TOF výrazně ovlivňuje množství a kvalitu získaných MS/MS dat. Vyvážením rychlosti akvizice, počtu prekurzorů na cyklus, aktivního vylučování prekurzorů a použití iterativních workflow lze dosáhnout vysokého pokrytí MS/MS bez zásadní ztráty kvality spekter. Volba mezi Auto MS/MS a Directed MS/MS závisí na účelu experimentu: Directed MS/MS je výhodný pro cílené získání informací o předem definovaných relevantních znacích, zatímco iterativní Auto MS/MS maximalizuje pokrytí při menší manuální náročnosti.

Reference

1. Sumner LW, Amberg A, Barrett D, Beale MH, Beger R, Daykin CA, Fan TWM, Fiehn O, Goodacre R, Griffin JL, et al. Proposed Minimum Reporting Standards for Chemical Analysis: Chemical Analysis Working Group (CAWG) Metabolomics Standards Initiative (MSI). Metabolomics 2007;3(3):211–221.
2. Schymanski EL, Jeon J, Gulde R, Fenner K, Ruff M, Singer HP, Hollender J. Identifying Small Molecules via High Resolution Mass Spectrometry: Communicating Confidence. Environ Sci Technol 2014;48(4):2097–2098.
3. Durham SD, Yannel KE, Simmermaker C, Van de Bittner G, Bertram L, Cuthbertson D, Klein C. An End-to-End Untargeted LC/MS Workflow for Metabolomics and Lipidomics. Agilent Technologies application note 5994-8371EN, 2025.
4. Yannell KE, Durham S, Simmermaker C, Van de Bittner G. Uncovering More Biological Insights in Your Samples with Routine LC/Q-TOF Workflows for Metabolites and Lipids. Agilent Technologies ASMS poster ThP-085, 2024.
5. Zhao L, Juck M. Protein Precipitation for Biological Fluid Samples Using Agilent Captiva EMR–Lipid 96‑Well Plates. Agilent application note 5991-9222EN, 2018.
6. Yannell KE, Simmermaker C, Van de Bittner G, Cuthbertson D. An End-to-End Targeted Metabolomics Workflow. Agilent application note 5994-5628EN, 2023.
7. Ferrer I, Thurman EM, Zweigenbaum JA. Auto MS/MS and Identification of Unknowns in Water Samples. Agilent technical overview 5994-0322EN, 2018.
8. Wu L, Wong DL. In-depth Peptide Mapping with Iterative MS/MS Acquisition on the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF. Agilent application note 5991-8633EN, 2020.
9. Koelmel J, Sartain M, Salcedo J, Murali A, Li X, Stow S. Improving Coverage of the Plasma Lipidome Using Iterative MS/MS Data Acquisition Combined with Lipid Annotator Software and 6546 LC/Q-TOF. Agilent application note 5994-0775EN, 2020.