Increased confidence in drug metabolite identification through intelligent data acquisition strategies and multiple fragmentation techniques on the Orbitrap Tribrid MS platform

Shrnutí: Zvýšená jistota při identifikaci metabolitů léčiv pomocí inteligentních akvizičních strategií a vícefragmen­tačních technik na platformě Orbitrap Tribrid

Význam tématu

Metabolitová identifikace (MetID) je klíčová v raném vývoji léčiv i při hodnocení bezpečnosti, protože metabolické přeměny ovlivňují farmakokinetiku, účinnost a potenciální toxicitu sloučenin. Robustní LC/MS workflow, který citlivě detekuje nízkou hladinu metabolitů v komplexních matricích a poskytuje spolehlivá fragmentační data, výrazně zvyšuje důvěru ve strukturální přiřazení a snižuje potřebu opakovaných analýz.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem white paperu bylo ukázat, jak kombinace inteligentních akvizičních přístupů (AcquireX, Met‑IQ s real‑time library search) a více typů fragmentace (CID, HCD, UVPD) na Orbitrap Tribrid platformě zlepšuje pokrytí fragmentačních dat pro metabolity a umožňuje jasnější lokalizaci míst biotransformace. Autory ilustrované příklady (nefazodone, losartan, diclofenac, propranolol) demonstrují zvýšenou schopnost detekce a strukturálního rozlišení isomerů a konjugátů.

Použitá metodika a instrumentace

• Instrumentace: Thermo Scientific Orbitrap IQ‑X Tribrid mass spectrometer v kombinaci s Vanquish UHPLC; zmíněny jsou také platformy Orbitrap Exploris 240, Orbitrap Eclipse a Orbitrap Ascend (mají obdobné funkce).
• Inteligentní softwarové nástroje: AcquireX inteligentní akvizice (automatické generování specifických vylučovacích a inkluzních seznamů), Met‑IQ data acquisition strategy s real‑time library search (RTLS), mzVault pro knihovny spekter, Compound Discoverer a Mass Frontier pro zpracování a predikci fragmentů.
• Fragmentační techniky: kolizně aktivovaná disociace (CID), higher‑energy collisional dissociation (HCD) a ultrafialová fotodissociace (UVPD) s vestavěným 213 nm laserem (2.5 kHz) pro generování komplementárních fragmentů; multi‑stage MSn realizováno v lineárním ion­tapu s následným měřením v Orbitrapu nebo iontovém třídiči.
• Pracovní postupy: pořadí injekcí zahrnuje blank/matrix blank pro AcquireX, automatické vytvoření exkluzního seznamu (m/z, retenční čas, intenzita), následné analýzy s preferenční fragmentací „nových“/relevantních signálů; Met‑IQ využívá RTLS ke spouštění MS3 pouze u spekter podobných rodičovské sloučenině.

Hlavní výsledky a diskuse

• AcquireX background exclusion významně zvyšuje šanci fragmentovat nízko intenzní, ale analyticky relevantní metabolity tím, že vyloučí konstantní a abundatní signály z matric. Příklad: metabolit nefazodone (m/z 486.2266) byl fragmentován pouze při použití AcquireX, zatímco bez vylučovacího seznamu dominovaly pozadové ionty.
• Met‑IQ s RTLS umožňuje cílené získání MSn dat jen pro sloučeniny strukturálně podobné rodiči, čímž se zkracuje doba věnovaná irelevantním MS3 a zvyšuje se počet relevantně prozkoumaných metabolitů. U losartanu se počet metabolitů s dostupnými MS daty zvýšil z 10 na 24 oproti tradičnímu ddMS3.
• Multi‑stage fragmentace (MSn) v iontovém třídiči poskytla v příkladu nefazodone oxide klíčové fragmenty v MS3, které umožnily lokalizaci oxidace na ethylový postranní řetězec (identifikace fragmentů m/z 170 a 156), což nebylo možné jen z MS2.
• UVPD jako ortogonální disociační metoda generuje fragmenty, které často nejsou získatelné pomocí HCD/CID, čímž dovoluje lokalizovat labile modifikace a rozlišit izomery. Příklady: propranolol‑glukuronid, kde UVPD generovalo unikátní informativní ionty; u diklofenaku UVPD identifikovala acyl‑glukuronidové vázání a rozlišila dvě izomerické oxidované‑glukuronidované metabolity (různé fragmenty m/z 327 vs. 343 indikující rozdíl o 16 Da odpovídající lokalizaci oxidace).
• Kombinace inteligentních akvizic a vícefragmen­tačních režimů vedla podle uvedených údajů k 30–50% zlepšení MetID oproti konvenčním metodám díky vyšší frekvenci cíleného spouštění MS2/MS3 na metabolity související s léčivem.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší efektivita: méně opakovaných analýz díky lepšímu počtu užitečných fragmentačních spekter již z první série injekcí.
• Zvýšená míra přiřazení struktur: MSn a UVPD poskytují dodatečné fragmenty nezbytné pro lokalizaci míst biotransformace, zvláště u labile‑vazebných konjugátů (acyl‑glukuronidy, GSH addukty).
• Úspora instrumentálního času: Met‑IQ omezuje zbytečné MS3 akvizice, což umožňuje širší průzkum vzorku v rámci dostupného cyklu.
• Vhodné pro komplexní matice: AcquireX workflow redukuje interferenci z matrice a odhaluje nízce abundantní metabolity v in‑vitro i in‑vivo studiích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další integrace umělé inteligence a pokročilých knihoven spekter by mohla ještě zlepšit selektivitu RTLS a automatizované rozhodování během akvizice.
• Rozšíření použití UVPD a jiných ortogonálních technik fragmentace (např. elektronová disociační technika) pro řešení stále složitějších konjugátů a izomerů v MetID.
• Standardizace a sdílení kvalitních knihoven metabolitů (mzVault‑typ) umožní rychlejší automatickou detekci strukturálně příbuzných metabolitů v různých projektech a laboratořích.
• Optimalizace pracovních postupů pro vysokopropustné a klinicky orientované aplikace, kde je potřeba rychle a spolehlivě sledovat metabolity v biologických matricích v rámci QA/QC a farmakovigilance.

Závěr

Kombinace inteligentních akvizičních strategií (AcquireX, Met‑IQ s RTLS) a vícefragmen­tačních technik (MSn, UVPD) na platformě Orbitrap Tribrid zvýšila efektivitu a jistotu identifikace metabolitů. Tyto přístupy umožňují cíleně získat hluboká strukturální data pro relevantní sloučeniny v komplexních matricích, což urychluje interpretaci a snižuje potřebu opětovných analýz. Ortogonální fragmentace zvláště rozšiřuje schopnost lokalizovat transformace u labile konjugátů a rozlišit izomery, čímž přispívá k robustnějšímu MetID workflow v průmyslových i akademických aplikacích.

Reference

1. Comstock K., Du M., Jiang M. Confident drug metabolite identification using an intelligent data acquisition and processing workflow. Thermo Fisher Scientific Application Note 65953, 2021.
2. Ruan Q., Comstock K. A New Workflow for Drug Metabolite Profiling by Utilizing Advanced Tribrid Mass Spectrometry and Data‑Processing Techniques. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2021, 32, 2050–2061.
3. Wang K., Hackbusch S., Comstock K., Coe K.J. Efficient and Comprehensive Metabolite Identification by Utilizing Automatic Background Exclusion and Specific Filtering Features of the Orbitrap ID‑X Tribrid Mass Spectrometer. Proceedings of the 67th ASMS Conference, Atlanta, GA, USA, June 2–6, 2019.
4. Bills B.; et al. Novel Real‑Time Library Search Driven Data Acquisition Strategy for Identification and Characterization of Metabolites. Anal. Chem. 2022, 94, 3749–3755.
5. Aoyama R.; et al. Real‑Time Library Search on Orbitrap IQ‑X Tribrid MS Enhances Metabolite Profiling. Proceedings of the 69th ASMS Conference, Philadelphia, PA, USA, Oct 31–Nov 4, 2021.
6. Van Vleet T.R.; et al. Acyl glucuronide metabolites: Implications for drug safety assessment. Toxicol Lett. 2017, 272, 1–7.
7. Ruan Q., Comstock K. Advanced Metabolite Profiling by using Tribrid Mass Spectrometry and Multiple Fragmentation Approaches. Proceedings of the 69th ASMS Conference, Philadelphia, PA, USA, Oct 31–Nov 4, 2021.
8. Wang K., Comstock K., Coe K.J. Application of Ultraviolet Photodissociation (UVPD) as Effective Approach to Localize Glucuronide and GSH Conjugates on Orbitrap IQ‑X Tribrid Mass Spectrometer. Proceedings of the 69th ASMS Conference, Philadelphia, PA, USA, Oct 31–Nov 4, 2021.