Spectro-electrochemiluminescence study of simultaneous emission from two luminophores

Význam tématu

Elektrogenerovaná chemiluminiscence (ECL) je citlivá a selektivní technika, kde excitované emisní stavy vznikají při elektrochemických přenosech elektronů na elektrodovém povrchu. Schopnost řídit časový i prostorový průběh generace excitovaných stavů dělá ECL užitečnou pro analytiku stopových látek, multi‑markerové stanovení a charakterizaci nových luminoforů. Studium simultánní emise z více luminoforů a fenoménu rezonančního přenosu energie (RET) rozšiřuje možnosti multiplexního měření a interpretace signálů v komplexních systémech.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem Application Note AN-EC-039 bylo demonstrovat schopnost přístroje SpectroECL sledovat ECL signál z jedné i současně z více luminoforů a porovnat výkon dvou detekčních buněk: citlivého, nespektročleněného fotodiodového detektoru a mikrospektrometru poskytujícího rozlišení vlnových délek. Modelovým systémem byl luminol (dárce) s peroxidem vodíku jako koreaktantem a směs luminol + fluorescein jako systém RET (dárce→akceptor).

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Elektrochemie: lineární sweep voltammetrie (0,00 V → +1,00 V) při 0,05 V/s.
• Rostoucí složení: 0,002 mol·L⁻¹ luminol, 0,05 mol·L⁻¹ H2O2 v 0,1 mol·L⁻¹ PBS pH 8; pro studium RET doplněno 0,0001 mol·L⁻¹ fluoresceinem.
• Sledování: simultánní záznam elektrochemického průběhu a emitovaného světla; u mikrospektrometru získávání spekter a funkce „Spectra vs EC“ pro časově/potenciálové mapování emisí.

Použitá instrumentace:

• SPECTROECL přístroj (integrovaný biopotenciostat/galvanostat a optická buňka).
• Microspectrometer cell – optická buňka s mikrospektrometrem umožňující záznam emisního spektra v závislosti na potenciálu.
• ECLPHOTODIODCELL – ABS buňka s křemíkovou fotodiodou s předzesilovačem (spektrální rozsah 340–1100 nm, maxima citlivosti ~960 nm) pro záznam celkové intenzity ECL bez rozlišení vlnových délek.
• Screen‑printed electrodes (SPE, Gold SPE 110) pro jednoduchou, reprodukovatelnou elektrochemickou platformu.
• Příslušenství: spojovací kabely (CAST, i‑µStat konektor) a software DropView SPELEC pro synchronizaci elektrochemických a optických dat a jejich vyhodnocení.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčové pozorované body:

• Pro systém luminol + H2O2 byla v LSV pozorována oxidační vrcholová špička při ~+0,30 V, která přesně koresponduje s nástupem emisního signálu ECL.
• Mikrospektrometr registroval u luminolu jedno emisní pásmo se střední hodnotou ~425 nm. ECL amplituda rostla během oxidace luminolu a dosahovala maxima v okolí +0,30 V.
• Při přítomnosti fluoresceinu (RET systém) byla bez spektroskopického rozlišení fotodiodou pozorována zvýšená celková intenzita při oxidačním vrcholu, avšak bez možnosti rozlišit složky od luminolu a fluoresceinu.
• Mikrospektrometr v systému luminol + fluorescein detekoval dvě oddělená pásma: ~425 nm (luminol) a ~530 nm (fluorescein), čímž potvrdil přenos excitační energie z luminolu na fluorescein (RET). Emise obou složek dosahovaly maxima současně s oxidační událostí při ~+0,30 V.
• Quantitativně byla emise luminolu výraznější než emise fluoresceinu při použitých koncentracích, což umožňuje odhad relativního přínosu jednotlivých luminoforů díky spektrálnímu rozlišení.

Diskuse:

• Fotodiodový detektor je vynikající pro citlivé detekce velmi nízkých intenzit ECL a pro aplikace, kde není potřeba spektrální informace (jednosložkové analýzy, screening).
• Mikrospektrometrické řešení je nezbytné pro systémy s vícero luminofory, pro identifikaci RET a pro vývoj či charakterizaci nových luminoforů, protože poskytuje simultánní spektrální a elektrochemické mapování.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy a aplikace:

• Umožňuje rozeznat a kvantifikovat příspěvky dvou nebo více luminoforů v jednom měření, což je klíčové pro multiplexní bioanalytické sady a sondy.
• Poskytuje rychlé spojení elektrochemického signálu s emisní spektroskopií, vhodné pro optimalizaci poměrů koreaktantů a luminoforů.
• Malé, přenosné a ekonomické řešení se screen‑printed elektrodami je vhodné pro polemické nebo bodové testování (POC), environmentální monitoring a analýzy reálných vzorků.
• Vysoká citlivost fotodiodového detektoru je výhodná pro detekci stopových koncentrací jedné značky, zatímco mikrospektrometr zlepšuje selektivitu v multianalytech.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry dalšího vývoje a aplikací:

• Rozvoj kvantitativních protokolů pro rozdělení příspěvků jednotlivých luminoforů ve směsích a kalibrace RET efektů.
• Časově rozlišené ECL (time‑resolved ECL) ke zlepšení separace překrývajících se emisních složek a ke studiu kinetiky RET procesů.
• Integrace s mikrofluidikou a vícekanálovými SPE pro paralelní multiplexní měření v malých objemech.
• Vývoj nových luminoforů s posunutými emisními pásmy a vyšší kvantovou účinností pro zvýšení citlivosti a rozlišení v multikanálových analýzách.
• Automatizované datové zpracování a strojové učení pro dekonvoluci spekter a robustní interpretaci signálů v komplexních matricích.

Závěr

SpectroECL kombinuje elektrochemickou stimulaci a optickou detekci umožňující buď vysoce citlivé měření celkové ECL intenzity (fotodioda) nebo spektrální dekonvoluci simultánních emisí (mikrospektrometr). Studie modelového systému luminol/H2O2 a luminol/fluorescein/H2O2 jasně ukázala, že oxidační proces luminolu při ~+0,30 V je zdrojem emisí a že RET na fluorescein je přímo detekovatelný jako druhé emisní pásmo (~530 nm). Výběr detektoru závisí na analytických cílech: fotodioda pro maximální citlivost jednosložkových měření, mikrospektrometr pro multiparametrické a multimarkerové analýzy.

Reference

1. Richter MM. Electrochemiluminescence (ECL). Chem. Rev. 2004, 104, 3003–3036. DOI: 10.1021/cr020373d.
2. Hu L.; Xu G. Applications and Trends in Electrochemiluminescence. Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 3275–3304. DOI: 10.1039/b923679c.
3. Ballesta-Claver J.; Valencia-Mirón M.C.; Capitán-Vallvey L.F. Disposable Electrochemiluminescent Biosensor for Lactate Determination in Saliva. Analyst 2009, 134, 1423–1432. DOI: 10.1039/b821922b.
4. Yildiz G.; Tasdoven U.; Menek N. Electrochemical Characterization of Luminol and Its Determination in Real Samples. Analytical Methods 2014, 6, 7809–7813.
5. Neves M.M.P.S.; Bobes-Limenes P.; Pérez-Junquera A. et al. Miniaturized Analytical Instrumentation for Electrochemiluminescence Assays: A Spectrometer and a Photodiode-Based Device. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2016, 408, 7121–7127. DOI: 10.1007/s00216-016-9669-7.