Benchmarking Resolution and Recovery of BioResolve™ 1 mm ID C18 RP Columns with MaxPeak™ Premier Technology

Význam tématu

Mikroflow chromatografie v proteomice kombinuje sníženou spotřebu vzorku a rozpouštědel s výhodami lepšího rozhraní k hmotnostní spektrometrii (MS), což vede ke zvýšené citlivosti a efektivitě analýz. Problémem v praxi je však náchylnost kyselých a fosforylovaných peptidů k nespecifické adsorpci na kovové části chromatografického systému, což degraduje signál a reprodukovatelnost výsledků. Studie hodnotí, do jaké míry kombinace BioResolve Peptide C18 RP sloupce (1.0 mm ID) a MaxPeak Premier hardwaru s vysokovýkonnými povrchy (HPS) zamezuje těmto sekundárním interakcím, zlepšuje výtěžnost a tvar píků od první injekce a tím zvyšuje kvalitu MS dat.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo porovnat výkon BioResolve Peptide C18 RP 1.0 x 100 mm (MaxPeak Premier Technology) s třemi komerčně dostupnými mikroflow sloupci podobných rozměrů (dvě 1.0 mm ID varianty označené Column K a Column Y a jedna širší 1.5 mm ID Column H). Hodnoceny byly zejména: peak capacity pro neacidické peptidy, tvar píků a recovery pro kyselé a fosforylované peptidy od první injekce, nároky na kondicionování sloupce a kvalita generovaných MS spekter. Vzorek tvořil standardní MassPREP Enolase Digest s přidanou směsí fosfopeptidů.

Použitá metodika

• Vzorek: MassPREP Enolase Digest with Phosphopeptides Mix, rekonstituovaný v 0,1 % kyselině mravenčí (100 µL).
• Chromatografie: gradientní RP-MS na 1.0 x 100 mm sloupcích (a srovnávací 1.5 x 100 mm), teplota kolony 60 °C, teplota vzorku 6 °C, injekční objem 1 µL.
• Fáze mobilní: A = 0.1 % HCOOH ve vodě; B = 0.1 % HCOOH v acetonitrilu.
• Vyhodnocení separation: 4σ peak capacity vypočteno z průměru čtyř neacidických peptidů; sledovány extrahované iontové chromatogramy (XIC) pro čtyři fosfopeptidy a čtyři kyselé peptidy.

Použitá instrumentace

• HPLC systém: ACQUITY Premier UPLC (mikrotubing, flow diverter do MS s 40 µm ID x 30 in tubing před zdrojem).
• Sloupce testované v porovnání: BioResolve Peptide C18 RP 1.7 µm, 130 Å, BEH, 1.0 x 100 mm (MaxPeak Premier); Column K (core–shell C18 1.7 µm, 1.0 x 100 mm); Column Y (C18 1.9 µm, 1.0 x 100 mm); Column H (core–shell C18 2.7 µm, 1.5 x 100 mm).
• Vialy: QuanRecovery MaxPeak 12 x 32 mm propylénové 300 µL šroubovací vialy.
• MS: Xevo G2, ESI+, low-flow probe; rozsah 50–2000 m/z; vzorkovací frekvence 1 Hz; capillary 2.50 kV; cone voltage 30 V; source 120 °C; desolvation 250 °C; cone gas 50 L/h; desolvation gas 350 L/h; lockmass LeuEnk (556.27658 m/z).
• Informatika: waters_connect software pro sběr a zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• Peak capacity: BioResolve 1.0 mm dosáhl průměrné peak capacity pro neacidické peptidy o více než 10 % vyšší než Column K a Column Y; Column H (1.5 mm) vykázal mírně vyšší peak capacity, což je konzistentní s nižší post-column dispersi pro širší ID.
• Recovery fosfopeptidů: Na BioResolve byly všechny čtyři sledované fosfopeptidy (včetně dvojitě fosforylovaného T43pp) zřetelně detekovány již při první injekci. U ostatních sloupců byla detekce T43pp na první injekci omezená nebo chybějící a vyžadovala opakované injekce pro dosažení plné recovery.
• Kinetika kondicionování: Peak area T43pp na BioResolve se ustálila již k třetí injekci, zatímco Column K, Y a H vykazovaly postupný nárůst peak area i po pěti injekcích, což ukazuje na potřebu delšího kondicionování u alternativních sloupců.
• Tvar píků a tailing: BioResolve měl nejmenší tailing fosfopeptidů i kyselých peptidů při první injekci; USP tailing faktor pro T19p byl nižší na BioResolve už bez kondicionování. Column K a Y i po kondicionování vykazovaly vyšší tailing a širší, asymetrické píky; Column H potřeboval nejintenzivnější kondicionování.
• Kvalita MS spekter: Čistota a intenzita signálu u BioResolve byly lepší — u testovaného peptidu T35 byl intenzitní signál tripletního iontu (~625.33 m/z) na BioResolve o více než 40 % vyšší než na alternativních sloupcích; Column K a H vykazovaly vysoký baseline šumu, Column Y vykazoval známky column bleed se signály dominujícími při m/z 149.04 a 223.06.
• Důsledky: Lepší chromatografické rozdělení kyselých a fosforylovaných peptidů přímo zlepšuje signál/noise poměr v MS, zvyšuje jistotu identifikací a snižuje potřebu opakovaných analýz.

Přínosy a praktické využití metody

• Okamžitá použitelnost: vylepšená povrchová úprava hardware u MaxPeak Premier minimalizuje potřebu dlouhého kondicionování, což zkracuje čas přípravy metody a zvyšuje laboratorní produktivitu.
• Vyšší citlivost a čistota spekter: lepší recovery a ostřejší píky pro kyselé/fosforylované peptidy zvyšují spolehlivost identifikací v bottom-up proteomice, zejména u stopových analyzovaných složek.
• Ekonomické a environmentální výhody: mikroflow režim s nižší spotřebou mobilních fází šetří náklady a snižuje enviromentální stopu laboratorních provozů.
• Robustnost pro rutinní workflow: stabilní výkon od první injekce je výhodný pro vysoko-propustné analýzy a velké koherentní studie (cohort studies), kde je důležitá reprodukovatelnost mezi dávkami.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Širší adopce mikroflow proteomiky: očekává se rostoucí nasazení 1.0 mm ID sloupců v kombinaci s optimalizovanými povrchy hardware pro klinické a velkosériové proteomické studie, kde jsou klíčové citlivost a úspornost.
• Další vylepšení povrchových technologií: vývoj nových HPS povrchů a inertních materiálů pro hardware může dále snížit sekundární interakce a zlepšit recovery i pro jiné „problematické“ analyty.
• Integrace s pokročilou informatikou: spojení robustních separací s platformami pro automatizované zpracování dat (např. waters_connect) umožní rychlejší a přesnější interpretaci velkých datových sad.
• Zelené laboratorní postupy: rozšíření mikroflow přístupů přispěje k udržitelnějším analytickým strategiím s nižší spotřebou rozpouštědel.

Závěr

BioResolve Peptide C18 RP 1.0 mm ID se technologii MaxPeak Premier prokázal ve srovnání se třemi komerčními sloupci jasné výhody: vyšší peak capacity pro neacidické peptidy, výrazně lepší recovery a tvar píků pro kyselé a fosforylované peptidy od první injekce, rychlejší stabilizaci signálu a čistší MS spektra. Tyto vlastnosti snižují dobu kondicionování, zvyšují spolehlivost identifikací a činí řešení atraktivním pro mikroflow LC–MS proteomické workflow zaměřené na citlivé a reprodukovatelné výsledky.

Reference

1. Gao Y., Fillmore T. L., Munoz N., et al. High-Throughput Large-Scale Targeted Proteomics Assays for Quantifying Pathway Proteins in Pseudomonas putida KT2440. Front. Bioeng. Biotechnol., 2020, 8, 1–13.
2. Lennon S., Hughes C. J., Muazzam A., et al. High-Throughput Microbore Ultrahigh-Performance Liquid Chromatography-Ion Mobility-Enabled-Mass Spectrometry-Based Proteomics Methodology for the Exploratory Analysis of Serum Samples from Large Cohort Studies. J. Proteome Res., 2021, 20(3), 1705–1715.
3. Berthelette K., Collins C., Walter T. H. Improving Sensitivity and Analytical Method Greenness using MaxPeak Premier 1.0 mm Internal Diameter Columns. Waters Application Note. 720009221, 2026.
4. Hanna C. M., Koza S. M., Addepalli B. Enhanced Recovery and Peak Shape of Acidic Peptides with BioResolve 1 mm ID Columns with MaxPeak Premier Technology. Waters Application Note. 720009231, 2026.