Optimizing molecular weight determination: A comprehensive guide to SEC/GPC

Význam tématu

Size Exclusion Chromatography neboli GPC/SEC je klíčová metoda pro určení distribuce molekulových hmotností makromolekul jako jsou polymery biopolymery polysacharidy či proteiny. Přesné stanovení molekulové hmotnosti a její distribuce je nezbytné pro vývoj nových materiálů kontrolu kvality a pochopení funkčních vlastností ve výzkumu i průmyslové analýze.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem článku je představit komplexní postup separace a stanovení molekulové hmotnosti pomocí SEC/GPC včetně přípravy vzorku kalibrace a vyhodnocení dat s využitím systému KNAUER AZURA GPC/SEC s detekcí refrakčním indexem. Diskutují se kritické aspekty volby eluční fáze kalibračních standardů a strategie pro řešení běžných problémů.

Použitá metodika

• Separace je založena na rozdílech hydrodynamického objemu analyzovaných molekul bez chemických interakcí s pevnou fází
• Příprava vzorku v koncentracích 0,1–10 mg/ml ve vhodném rozpouštědle bez víření či odstřeďování, filtrace přes 0,45 µm
• Relativní kalibrace 5. řádu pomocí pullulanu ve vodě (180–1 450 000 Da) a polystyrenu v THF (266–66 000 Da), rozšířitelné sadou spatul EasiCal PS pro 580–6 545 000 Da
• Ověření počtu teoretických desek dle ISO 13885 (min. 10 000 pro vodu, 20 000 pro THF) a testy rozdělovacího rozsahu kolon

Použitá instrumentace

• KNAUER AZURA GPC/SEC systém s detektorem refrakčního indexu AZURA RID 2.1L
• Pumpa AZURA P 6.1L LPG a degasser dvoukanálový
• Autosampler AZURA AS 6.1L
• Termostat AZURA CT 2.1 pro kolony
• Kolonové hlavy AppliChrom SuperOH P-150 a P-350 pro vodné metody, StyDiViBe P-10E5A-BPT pro THF
• Software ClarityChrom 9.1.0 s rozšířením pro SEC/GPC

Hlavní výsledky a diskuse

Kalibrace pullulanu ve vodě a polystyrenu v THF prokázaly odchylky pod 7 % respektive 3 % s koeficientem korelace blízko 0,999. Kombinace kolon rozšířila separační rozsah na 100–1 000 000 Da a splnila požadavky ISO. Ověření pomocí známých cukrů a PS standardů ukázalo maximální odchylku 3 % u pullulanu a 4 % u polystyrenu. Diskuse zdůrazňuje význam volby kalibračních standardů odpovídajících chemickému složení vzorku a možnosti univerzální kalibrace s využitím Mark Houwink konstant.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a spolehlivé stanovení distribuce molekulových hmotností
• Univerzální aplikace v organických i vodných systémech
• Modulární konstrukce umožňuje přidání dalších detektorů a kolon
• Výsledky v souladu s mezinárodními normami ISO
• Vhodné pro polymerní výzkum farmacii biotechnologie a QA/QC

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj univerzální kalibrace pro různé makromolekuly
• Integrace viskozimetrických a MALS detektorů pro absolutní stanovení hmotnosti
• Automatizace přípravy vzorků a on-line monitoring stability
• Pokročilé metody analýzy heterogenity a složitých matric

Závěr

Systém KNAUER AZURA GPC/SEC potvrdil vysokou přesnost a spolehlivost pro stanovení molekulární hmotnosti v různých elučních systémech. Kalibrace odpovídaly požadavkům ISO a odchylky nepřesáhly 4 %. Dodržování správných postupů přípravy vzorku a volba vhodných standardů jsou klíčové pro validní výsledky.

Reference

• DIN EN ISO 13885-3 Gelpermeationschromatographie GPC Teil 3 Wasser als Elutionsmittel 2021
• DIN EN ISO 13885-1 Gelpermeationschromatographie GPC Teil 1 THF als Elutionsmittel 2021
• Radke W Tips Tricks Column Order in GPC SEC LCGC International 2022
• Kempf B Which GPC Column First LCGC International 2010
• Heinzmann G Heinzmann A Heinzmann S Die universelle Kalibrierung in der Gelpermationschromatographie Analytik NEWS 2023