Context matters: selecting LC-MS sample preparation methods for LC-MS/MS in clinical research and toxicology applications

Význam tématu

Metoda kapalinové chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií (LC-MS) se stala klíčovým nástrojem v klinických a toxikologických laboratořích díky schopnosti provádět široký a nestanovený screening látek v různých biologických matricích. Správná příprava vzorku zásadně ovlivňuje citlivost, přesnost a robustnost analýzy a prodlužuje životnost analytického zařízení.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované studie bylo porovnat tři standardní metody přípravy vzorků (precipitace proteinů, liquid-liquid extrakce a solid-phase extrakce) s ohledem na detekční citlivost terapeutických a narkotických látek ve vzorcích séra. Výzkum proběhl v Ghent University Hospital s využitím Thermo Scientific Tox Explorer Collection.

Použitá metodika a instrumentace

Pro všechny tři způsoby přípravy bylo použito 250 µl séra (50 µl u precipitace) a identické parametry LC-MS: vysoké rozlišení 35 000 (full scan), 17 500 (MS/MS), okno izolace 2,0 m/z a rychlé přepínání polarity. Instrumentace zahrnovala Orbitrap Exploris 120 pro HRAM a triple kvadrupólový TSQ Quantis Plus. K identifikaci a kvantifikaci sloužilo software Thermo Scientific TraceFinder s databází Tox Explorer.

Hlavní výsledky a diskuse

• Solid-phase extrakce dosáhla nejvyšší míry detekce sloučenin (89 z 102 při středních koncentracích) a zároveň nejnižších detekčních limitů.
• Liquid-liquid extrakce se prokázala téměř stejně účinná (84/102) a nabízela dobrou rovnováhu mezi koncentrací analytů a potlačením matricových interferencí.
• Proteinová precipitace vykázala nejnižší citlivost (77/102) a nižší schopnost obohatit analyt, avšak je nejrychlejší a nejlevnější.
• Problémy s detekcí se objevily zejména u barbiturátů a kanabinoidů, pravděpodobně kvůli odlišným ionizačním vlastnostem.
• Koeficient variační přesnosti (CV) interních standardů byl v rámci jedné analýzy do 10 %, přičemž u více než 75 % analytů CV nepřesáhl 30 %, což je vyhovující pro klasifikaci terapeutických i toxických hladin.

Přínosy a praktické využití metody

• Výběr vhodné přípravy vzorku umožňuje optimalizovat citlivost, přesnost a dobu bezúdržbového provozu LC-MS.
• Automatizace (robotické systémy, SPE 96-jamkové formáty) výrazně zvyšuje průchodnost a snižuje odbornost potřebnou k provozu.
• Flexibilní workflow podle typu vzorku (vysokoproteinové vs. nízkoproteinové matice) zajišťuje pokrytí širokého spektra analýz od terapeutických léčiv po drogy zneužívání.
• Využití komerčních kalibrátorů a kontrol zjednodušuje validaci metod a snižuje náklady na přípravu standardních roztoků.

Budoucí trendy a možnosti využití

S očekávaným dalším zjednodušováním LC-MS instrumentace se otevírá možnost širšího nasazení i v menších laboratořích. Zvýšené zájmy se očekávají v oblasti simultánní detekce proteomů, metabolomů a imunoterapeutik. Vývoj nových sorbentů a on-line extrakčních systémů sníží dobu přípravy a zvýší throughput. Integrace strojového učení ve vyhodnocování dat může dále zlepšit citlivost a selektivitu.

Závěr

Výběr metody přípravy vzorku pro LC-MS značně ovlivňuje analytické parametry i provozní efektivitu. Precipitace je nejjednodušší a nejrychlejší, zatímco SPE poskytuje nejvyšší citlivost. Správná volba by měla reflektovat typ matice, požadovanou detekční hranici, kapacitu laboratoře a požadavky na validaci.

Reference

1. Koal T., Schmiederer D., Pham-Tuan H., Röhring C., Rauh M. Standardized LC-MS/MS based steroid hormone profile-analysis. J. Steroid Biochem. Mol Biol. 2012, 129:129–138.
2. Yuan T.F., Le J., Cui Y., Peng R., Wang S.T., Li Y. An LC-MS/MS analysis for seven sex hormones in serum. J. Pharm. Biomed. Anal. 2019, 162:34–40.
3. Li H. et al. General LC-MS/MS method approach to quantify therapeutic monoclonal antibodies. Anal. Chem. 2012, 84(3):1267–1273.
4. Fresnais M. et al. LC-MS-based quantification assay for therapeutic antibodies. ACS Omega. 2020, 5(38):24329–24339.
5. McDonald M.G. et al. New LC-MS assay for vitamin K metabolites. J. Lipid Res. 2019, 60(4):892–899.
6. Jenkinson C. et al. High throughput LC-MS/MS for vitamin D analytes. J. Chromatogr. B. 2016, 1014:56–63.
7. Nakano Y. et al. High-throughput LC-MS/MS method for chiral amino acids. Methods Mol. Biol. 2019, 2030:253–261.
8. Onozato M. et al. LC-MS/MS analysis of thiol-containing amino acids. J. Chromatogr. Sci. 2020, 58(7):636–640.
9. Donners A.A.M.T. et al. Comparison of coagulation factor VIII assays by MS. Int. J. Lab. Hematol. 2020, 42(6):819–826.
10. El Amrani M. et al. Quantification of coagulation factor VIII with camelid nanobodies. J. Pharm. Biomed. Anal. 2019, 175:112781.
11. Tong X.S. et al. High-throughput pharmacokinetics of VLA-4 antagonists. J. Pharm. Biomed. Anal. 2004, 35(4):867–877.
12. Bjørk M.K. et al. Quantification of 31 drugs in whole blood by SPE automation. Anal. Bioanal. Chem. 2013, 405(8):2607–2617.
13. Johnson-Davis K.L. Opiate & benzodiazepine confirmations: hydrolyze or not? J. Appl. Lab. Med. 2018, 2(4):564–572.
14. Remane D., Wissenbach D.K., Peters F.T. Recent advances in LC-MS in clinical and forensic toxicology. Clin. Biochem. 2016, 49(13-14):1051–1071.
15. Van Natta K.L. et al. LC-MS/MS toxicology workflow on Orbitrap Exploris 120. Thermo Fisher Sci. TN 000794.
16. Thompson J.P. et al. Guidelines for poisoned patients in the UK. Ann. Clin. Biochem. 2014, 51:312–325.
17. ANSI/ASB. Standard Practices for Method Validation in Forensic Toxicology. Standard 036. 2019.
18. GTFCh. Recommendations for validation of analytical methods for clinical toxicology. 2018.
19. ANSI/ASB. Analytical Testing of Urine in Drug Facilitated Crime Investigations. Standard 121. 2021.
20. ANSI/ASB. Analytical Testing of Blood in Impaired Driving Investigations. Standard 120. 2021.
21. ANSI/ASB. Analytical Testing of Blood in Medicolegal Death Investigations. Standard 119. 2021.