A Software Workflow Using Wide Mass Range Single Quadrupole Mass Spectrometry Data Stream Applied to Oligonucleotides Confirmation

Význam tématu

Oligonukleotidové terapie, včetně antisense oligonukleotidů (ASO) a siRNA, vyžadují přesné potvrzení molekulové hmotnosti a profilů nečistot. Masová spektrometrie s elektrospray ionizací (ESI) je pro tyto makromolekuly vhodná, ale vyžaduje optimální rozsah akvizice a kvalitní software pro zpracování dat. Rozvoj přístrojů se širším rozsahem hmotnostního poměru přináší komplexnější a automatizovanou analýzu, což zrychluje vývoj a kontrolu terapeutických oligonukleotidů.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem studie bylo ukázat využitelnost prototypu jediného kvadrupólového LC-MS přístroje s rozšířeným hmotnostním rozsahem (m/z 600–3000) pro potvrzení plně dlouhovlnného produktu (FLP) a kvantifikaci oligonukleotidů. Studie porovnávala omezené skenovací okno (600 Da šířka) a plnohodnotný rozsah akvizice při konstantní rychlosti sběru dat a vyhodnocovala dopad na identifikaci i kvantifikaci ASO modelových vzorků.

Použitá metodika a instrumentace

Pro chromatografii byla použita iontově párová LC na Shim-pack Scepter Claris kolonce s bioinertní úpravou a mobilní fází A (10% acetonitril, 5 mM tributylammonium acetát, 1 µM EDTA) a fází B (80% acetonitril, 5 mM TBuAA, 1 µM EDTA).
Detekci zajišťoval prototyp LCMS-2050 se změněnou RF frekvencí umožňující m/z až 3000, ve spojení s LabSolutions Insight Biologics softwarem pro plnohodnotné zpracování FLP sekvencí.

• Chromatograf: Shimadzu Nexera XS LC-40 (bioinertní povrch)
• Kolonka: Shim-pack Scepter Claris, iontově párová
• Mass spektrometr: Prototyp jediné kvadrupólové jednotky, plný rozsah m/z 600–3000
• Software: LabSolutions Insight Biologics
• Podmínky ESI: negativní iontový mód, interface voltage –3 kV, teplota odpařování 450 °C, profilový mód

Hlavní výsledky a diskuse

Studie prokázala, že plný rozsah akvizice minimalizuje potřebu předběžné volby nabitých stavů a zajišťuje bezobslužnou analýzu:

• Potvrzení FLP 20-meru (mipomersen) s dekonvoluovanou hmotností 7176 Da a 30-meru (PolyT30) s hmotností 9063 Da.
• Porovnání omezeného skenovacího okna a plného rozsahu ukázalo srovnatelnou identifikaci, avšak plný rozsah poskytl komplexnější údaje bez nutné optimalizace nabitých stavů.
• Kvantitativní analýza summací signálů všech hlavních nabitých stavů (z = –4 až –6) vykázala vyšší přesnost (R2 = 0,9999) a lepší limit detekce než analýza jednoho stavu.
• Mobilní fáze s TBuAA a EDTA vykazovala vyšší intenzitu signálů a příznivější rozložení nabitých stavů než HFIP/TEA.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda s prototypovým jediným kvadrupólem nabízí rychlé potvrzení molekulové hmotnosti a profilování nečistot oligonukleotidů bez složité optimalizace. Plnohodnotná akvizice šetří čas a snižuje potřebu opakovaných analýz. Summace nabitých stavů zvyšuje spolehlivost kvantifikace, což je klíčové pro vývoj a kontrolu kvality terapeutických oligonukleotidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další práce se zaměří na širší spektrum oligonukleotidů, například sgRNA (>15 kDa), a na kvantitativní aplikace v bioanalytice. Vývoj směsích iontově párových reagencií a vylepšení softwaru pro automatizované zpracování dat povede k vyšší citlivosti a robustnosti metod.

Závěr

Prototyp jediného kvadrupólového LC-MS s rozšířeným m/z rozsahem poskytuje efektivní a spolehlivou platformu pro potvrzení molekulových hmotností a kvantifikaci oligonukleotidů. Kombinace plné akvizice a sofistikované softwarové analýzy zajišťuje rychlou a přesnou charakterizaci, což usnadňuje vývoj a kontrolu kvality léčebných oligonukleotidů.

Reference

V původním textu nebyly uvedeny žádné konkrétní literární reference.