Rapid Identification of the In Vivo Biotransformations of a Targeted Protein Degrader (PROTACs) Using Xevo G3 QTof and waters_connect Software Platform

Význam tématu

PROTACs představují novou strategii v medicíně umožňující kompletní degradaci cílových proteinů prostřednictvím ubiquitin-proteasomálního systému. Pochopení jejich in vivo metabolizmu je klíčové pro optimalizaci farmakokinetiky, bezpečnosti a účinnosti těchto molekul.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo charakterizovat a identifikovat in vivo metabolity modelového PROTACs–3–gefitinibu po subkutánním podání potkanům pomocí UHPLC-HRMS v režimu DIA a automatizované platformy waters_connect.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky plazmy a moče odebrané v časových intervalech po dávce 10 mg/kg byly připraveny precipitací s acetonitrilem/methanolem. Chromatografie probíhala na systémech ACQUITY Premier UPLC s kolonou HSS T3 (2.1×100 mm, 1.8 µm) při 60 °C, gradientním elucentem 0.1 % kyseliny mravenčí a 1 mM formiátu amonného v A (voda) a 95 % ACN v B, tok 0.6 mL/min, injekce 2 µL, 10 min. Detekce byla realizována na Xevo G3 QTof v kladném módu ESI, MSE (nízké/ vysoké CE), 0.1 s sken. Data byla zpracována softwarem waters_connect pro identifikaci metabolitů.

• ACQUITY Premier UPLC System
• ACQUITY UPLC HSS T3, 100 Å, 1.8 µm, 2.1×100 mm
• Xevo G3 QTof Mass Spectrometer (ESI+, DIA)
• waters_connect Software Platform (UNIFI)

Hlavní výsledky a diskuse

Bylo detekováno 9 in vivo metabolitů, které vznikají především štěpením alifatického linkeru (N-dealkylace, hydrolytické štěpení amidu), dále oxidacemi na terapeutickém a ligasním modulu a následnými konjugacemi (sulfát, glukuronid). Vznikají fragmenty s diagnostickými ionty m/z 617, 318 a 188, které potvrdily strukturu mateřské látky. Metabolit M6 (m/z 525.2165, Δ 2 ppm) odpovídá ligasnímu fragmentu po redukci a modifikaci, jehož koncentrace v moči dosáhla maxima mezi 3–8 h a přetrvávala do 24 h.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow umožnil rychlou a senzitivní detekci stopových metabolitů, přesnou lokalizaci míst biotransformace, snížení falešných pozitiv a urychlení hodnocení ADME profilů v raných i pozdních fázích vývoje.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj spočívá ve využití iontové mobility, strojového učení pro predikci metabolitů, integraci in vitro-in vivo korelací a personalizovaném profilu metabolizmu PROTACs.

Závěr

Komplexní analýza spojena s vysokým rozlišením a chemoinformatickým zpracováním prokázala efektivní a rychlou identifikaci in vivo metabolitů PROTACs–3–gefitinibu, což přispívá k lepšímu porozumění farmakokinetickým vlastnostem těchto inovativních léčiv.

Reference

1. Békés M, Langley DR, Crews CM. PROTAC targeted protein degraders: the past is prologue. Nat Rev Drug Discov. 2022;21(3):181–200.
2. Murray KJ et al. Discovery of Modified Metabolites, Secondary Metabolites, and Xenobiotics by Structure-Oriented LC-MS/MS. Chem Res Toxicol. 2023;36(11):1666–1682.
3. Wen B, Zhu M. Applications of mass spectrometry in drug metabolism: 50 years of progress. Drug Metab Rev. 2015;47(1):71–87.
4. Molloy BJ et al. Investigation of the pharmacokinetics and metabolic fate of Fasiglifam (TAK-875) in rats. Xenobiotica. 2023;53(2):93–105.
5. Goracci L et al. Understanding the Metabolism of PROTACs: The Next Step toward Pharmaceutical Applications. J Med Chem. 2020;63(20):11615–11638.
6. McKillop D et al. Metabolic disposition of gefitinib in rat, dog and man. Xenobiotica. 2004;34:917–934.
7. Molloy BJ et al. Rapid determination of the pharmacokinetics and metabolic fate of gefitinib in the mouse. Xenobiotica. 2021;51:434–446.