Key LC-MS Publications for Analysis of Host Cell Proteins in Biopharmaceuticals

Význam tématu

Analýza hostitelských proteinů (HCP) v biotechnologických produktech je klíčová pro zajištění kvality a bezpečnosti terapeutických protilátek. HCP představují nežádoucí nečistoty, které mohou ovlivnit stabilitu, účinnost a imunogenní potenciál bioterapeutik. Moderní metody LC-MS umožňují citlivou detekci a kvantifikaci HCP v rozsahu stopových koncentrací, což podporuje robustní procesní kontrolu a splnění regulatorních požadavků.

Cíle a přehled studie

Shrnuté práce se zaměřují na:

• Vývoj a optimalizaci workflow pro detekci HCP při biologické koncentraci terapeutických mAb.
• Srovnání nete­lujících a standardních tryptických digestí z hlediska pokrytí proteomu.
• Implementaci datově nezávislé akvizice (DIA) s následnou validací paralelní reakcí (PRM).
• Vyhodnocení dynamického rozsahu a přesnosti kvantifikace HCP ve fed-batch kulturách CHO buněk.
• Porovnání přístupů Data Dependent Acquisition (DDA) s použitím inkluzních/exkluzních seznamů.

Použitá metodika a instrumentace

Principy metod:

• Netušící tryptická digestie s a bez odstranění nedigestovaného mAb.
• DIA-MS následované PRM validací pro kvantifikaci peptidů.
• Label-free kvantifikace HCP ve fermentačních supernatantech.
• DDA-MS s využitím inkluzních/exkluzních seznamů pro zvýšení citlivosti detekce.

Hlavní instrumentace:

• Thermo Scientific Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ (HRAM Orbitrap)
• Thermo Scientific Q Exactive™ (High-resolution Accurate-Mass)
• Thermo Scientific LTQ Orbitrap™

Hlavní výsledky a diskuse

Detekční limity a pokrytí proteomu:

• Citlivá detekce spiko­vaných rekombinantních HCP až do 0,5 ppm při koncentraci mAb 12,5 mg/mL.
• Srovnání s 2D-HPLC-MS: workflow s non-denaturing digestí identifikovalo více prote­inů než tradiční postup.
• DIA-MS+PRM přinesla vyšší reprodukovatelnost kvantifikace než samostatné 2D-HPLC-MS, i když celkový počet identifikovaných proteinů byl podobný.
• Label-free analýza supernatantů CHO buněk odhalila dynamiku HCP během fed-batch kultivace a umožnila klasifikaci dle GO anotací.
• DDA s inkluzní/exkluzní listou zlepšila detekci cílených HCP ve vzorcích po Protein A purifikaci.

Přínosy a praktické využití metody

Implementované LC-MS workflow:

• Poskytují citlivé a specifické profily HCP pro procesní vývoj i QA/QC.
• Umožňují rychlou identifikaci kritisch­kých HCP („hitch-hiker“ proteiny) vznikajících při Protein A purifikaci.
• Zlepšují porovnatelnost produktů (comparability) při změnách výrobního procesu nebo přechodu na biosimilars.
• Podporují monitorování klíčových atributů kvality (CQA) jako agregace, modifikace a vyšší řád struktury.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Pokročilé algoritmy pro zpracování DIA dat a strojové učení pro predikci problematických HCP.
• Využití multiplexovaných PRM metod pro simultánní kvantifikaci desítek až stovek HCP.
• Rozšířená integrace HDX-MS a nativní MS pro sledování konformačních změn HCP.
• Automatizovaná příprava vzorků na platformách s vysokou propustností pro screening budoucích bioprocessů.

Závěr

Shrnuté studie demonstrují, že moderní LC-MS/proteomické workflow poskytují robustní a vysoce citlivé nástroje pro komplexní profilování hostitelských proteinů. Díky kombinaci netušících digestí, DIA-MS, PRM a inkluzních/exkluzních DDA strategií lze dosáhnout maximálního pokrytí proteomu, spolehlivé kvantifikace a podpory regulato­rních požadavků pro bioterapeutika.

Reference

• Huang L, Wang N, Mitchell CE, Brownlee T, Maple SR, De Felippis MR. A Novel Sample Preparation for Shotgun Proteomics Characterization of HCPs in Antibodies. Analytical Chemistry. 2017;89(10):5436-5444.
• Kreimer S, Gao Y, Ray S, Jin M, Tan Z, Mussa NA, Tao L, Li Z, Ivanov R, Karger BL. Host Cell Protein Profiling by Targeted and Untargeted Analysis of Data Independent Acquisition Spectrometry Data with Parallel Reaction Monitoring Verification. Analytical Chemistry. 2017;89(10):5294-5302.
• Park JH, Jin JH, Lim MS, An HJ, Kim JW, Lee GM. Proteomic Analysis of Host Cell Protein Dynamics in the Culture Supernatants of Antibody-Producing CHO Cells. Scientific Reports. 2017;7:44246.
• Reisinger V, Toll H, Mayer RE, Visser J, Wolschin F. A Mass Spectrometry-based Approach to Host Cell Protein Identification and its Application in a Comparability Exercise. Analytical Biochemistry. 2014;463:1-6.
• Gilgunn S, Bones J. Challenges to Industrial mAb Bioprocessing - Removal of Host Cell Proteins in CHO Cell Bioprocesses. Current Opinion in Chemical Engineering. 2018;22:98-106.
• Háda V, Bagdi A, Bihari Z, Timária SB, Fizil Á, Szántay Jr C. Recent Advancements, Challenges, and Practical Considerations in the Mass Spectrometry-based Analytics of Protein Biotherapeutics: A Viewpoint from the Biosimilar Industry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2018;161:214-238.
• Bennett P, Wang HJ, Horn D, Hao Z, Zhang Y. Identification and Quantification of Trace-Level Protein Impurities. BioPharm International. 2013;26(9).
• Houel S, Huguet R, Abbatiello S, Sarracino D, Josephs J. Improving the Dynamic Range of Host Cell Proteins Analysis Using an HRAM Orbitrap Mass Spectrometer. ASMS Poster. 2018.
• Houel S, Blank M, Huguet R, Sharma S, Samonig M, Zabrouskov V, Josephs J. Evaluation of Factors Affecting Detection of Host Cell Proteins in Biotherapeutic Proteins Using an Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer. ASMS Poster. 2017.
• Blank M, Houel S, Josephs J. Detection and Identification of New Features as Part of Mass Spectrometry-based Quality Control. ASMS Poster. 2017.