Next Steps in AAV Characterization via Light Scattering Measuring AAV Critical Quality Attributes

Význam tématu

Vektor adeno-asociovaného viru (AAV) se díky nízké imunitní odpovědi a schopnosti efektivně doručovat genový náklad stal klíčovým nástrojem genové terapie. Přesná charakterizace kritických kvalitativních parametrů (CQA) AAV, jako je koncentrace částic, podíl prázdných a plných kapsid a míra agregace, je nezbytná pro zajištění bezpečnosti, účinnosti a reprodukovatelnosti terapeutických produktů.

Cíle a přehled studie

Publikace představuje integrovaný analytický přístup založený na technikách světelného rozptylu k hodnocení CQA AAV. Hlavním cílem je demonstrovat, jak SEC-MALS v kombinaci s dalšími metodami (FFF-MALS, DLS a Protein Conjugate Analysis) umožňuje:

• nezávislé stanovení molárních hmotností prázdných a plných kapsid,
• kvantifikaci nukleové kyseliny a proteinové složky,
• určení obsahu agregátů a monomerů v jediné analýze.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika spočívá v kombinaci separačních technik a trojdetekčního systému pro stanovení koncentrací a molárních hmotností:

• SEC-MALS: HPLC přístroj, DAWN® MALS detektor, Optilab® refrakční indexový detektor, UV detektor při 280 nm.
• Protein Conjugate Analysis: matematická dekonvoluce signálů pro oddělení proteinové a DNA složky.
• FFF-MALS: Eclipse™ AF4™ pro separaci velkých agregátů, DAWN® a Optilab® pro detekci.
• Batch DLS/SLS: rychlý screening velikosti (Rh) a molární hmotnosti (Mw).

Hlavní výsledky a diskuse

SEC-MALS přesně rozlišila prázdné kapsidy (Mw ~3,67 MDa, Rh ~14,7 nm) a plné částice (Mw ~6,78 MDa, Rh ~15,6 nm). Protein Conjugate Analysis umožnila kvantifikovat hmotu kapsidu a DNA separátně a vypočítat koncentraci úplných a prázdných částic. FFF-MALS ukázala schopnost odhalit a oddělit vyšší oligomery a agregáty, které SEC nemusí vždy úplně zachytit. Batch DLS poskytla rychlý přehled o rozdělení velikosti před uplatněním podrobnějších metod.

Přínosy a praktické využití metody

Celkový protokol SEC-UV-MALS-dRI umožňuje v jedné analýze:

• stanovení koncentrace všech kapsidových částic,
• určení podílu prázdných a plných virionů,
• kvantifikaci agregátů a monomerů,
• nezávislé stanovení molárních hmotností bez potřeby externích standardů.

Díky kombinaci detekce UV, MALS a dRI není nutné předchozí znalosti struktury ani obsahu AAV.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj vysokopropustných variant MALS a pokročilých separačních technik umožní zkrátit dobu analýzy a zvýšit automatizaci. Integrace mikrofluidních separací a strojového učení pro vyhodnocení dat otevře nové možnosti pro on-line monitorování výrobních procesů genové terapie. Metoda je aplikovatelná i na další virové vektory a nanoformulace.

Závěr

Popisovaný rámci založený na SEC-MALS, FFF-MALS a DLS poskytuje komplexní a spolehlivou charakterizaci AAV. Jednotlivé techniky se vzájemně doplňují a umožňují plně popsat kvalitu virových částic, což je zásadní pro účinnou a bezpečnou výrobu genových terapií.

Reference

• Anatolii Purchel, Michelle Chen, John Champagne. Next Steps in AAV Characterization via Light Scattering. Wyatt Technology Corporation.