CBD purification – Part 1: Preparative HPLC method development in analytical scale and scale-up

Význam tématu

Rostlinné extrakty bohaté na CBD vyžadují efektivní, šetrné a ekonomické metody purifikace. Přerušovací preparativní HPLC představuje výhodu oproti klasickým metodám díky nižší spotřebě energie, vody i chemikálií a současně vyšším výtěžkům.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie je vyvinout a optimalizovat analytickou HPLC metodu pro separaci hlavních kanabinoidů (CBD, ∆9-THC, CBC), aplikovat screeningové přehledné a zaměřené gradienty a následně přenést vybranou metodu na preparativní systém s využitím lineárního scale-upu.

Použitá metodika

• Přehledný gradient: identifikace retenčního chování na C18 kolónách (150×4 mm, 250×4 mm, 5 μm) se třemi eluenty (ethanol, acetonitril, methanol) a čtyřkrokovým gradientem (isokratická fáze, separace, wash, reekvilibrace).
• Focus gradient: optimalizace separace kolem piku CBD se zploštělým lineárním gradientem vypočteným pomocí Focused Gradient Calculator.
• Studie přetížení: určení maximální injekční objemové kapacity (10–100 μl) při zachování chromatografického rozlišení.
• Lineární scale-up: zvýšení průměru kolony z 4 mm na 20 mm, výpočet scale-up faktoru 25, úprava průtoku a injekčního objemu pomocí empirických rovnic.

Použitá instrumentace

1. Analytický systém: AZURA P 6.1L s HPG pumpou, AZURA DAD 2.1L, autosampler AS 6.1L, kolony Eurospher II C18 (150×4 mm, 250×4 mm), ClarityChrom 9.0.
2. Preparativní systém: AZURA P2.1L s LPG modulem, asistent ASM 2.2L, dynamický mixer, frakční kolektor, kolona Eurospher II C18 250×20 mm, PurityChrom 6.

Hlavní výsledky a diskuse

• Ethanol/H2O ukázal nejkratší retence a dobrou selektivitu, ∆9-THC vždy elutovalo mezi CBD a CBC.
• Kombinace kolony 250×4 mm (5 μm) a zaměřeného gradientu vedla k optimálnímu rozlišení CBD.
• Během optimalizace gradientu se doba analýzy zkrátila na polovinu a zároveň se snížila spotřeba eluční fáze o 50 %.
• Injekční objem nad 100 μl vedl k rozšíření píků a poklesu rozlišení, proto se preferuje rozsah do 50 μl pro analytickou metodu.
• Lineární scale-up faktoru 25 umožnil převod na kolonu 20 mm s průtokem 25 ml/min a injekcí 200 μl při zachování chromatografických parametrů.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a spolehlivá kontrola kvality CBD-bohatých extraktů.
• Jednoduchý přenos analytické metody na preparativní úroveň pro průmyslovou purifikaci.
• Snížení spotřeby eluentů, vody a energie v porovnání s konvenčními postupy.
• Flexibilita volby eluční fáze a adaptace na různé chemotypy extraktů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace a on-line monitorování procesů purifikace.
• Integrace s technikami superkritické fluidní chromatografie (SFC) pro ekologičtější separaci.
• Vývoj ultrapreparačních HPLC systémů pro vyšší průtoky a objemy injekce.
• Výzkum purifikace dalších minoritních kanabinoidů a bioaktivních složek konopí.

Závěr

Systematický postup od screeningové analýzy přes optimalizaci gradientů až po lineární scale-up přináší efektivní preparativní HPLC metodu pro purifikaci CBD. Metoda kombinuje vysoké rozlišení, úsporu zdrojů a jednoduchý přenos na větší měřítko.

Reference

• Blanc CL et al. Purification of organic acids by chromatography: Adsorption isotherms and impact of elution flow rate. Separation and Purification Technology 141 (2015).
• Pertwee RG. Handbook of Cannabis. Oxford University Press (2014).
• Aizpurua-Olaizola O et al. Evolution of the Cannabinoid and Terpene Content during the Growth of Cannabis sativa L. Journal of Natural Products 79 (2016).
• Turner CE et al. Constituents of Cannabis sativa L. XVII. A Review of the Natural Constituents. Journal of Natural Products 43 (1980).
• Hazekamp A. The Trouble with CBD Oil. Medical Cannabis and Cannabinoids 1 (2018).