Leveraging Analytical Quality by Design Principles for Efficient Development of a Targeted Assay Method for Routine Monitoring of Mannose-5 Glycans Using Fluorescence Detection

Význam tématu

Precizní a spolehlivá analýza vysokomanózních N-glykanů, zejména Man-5, je klíčová pro hodnocení kvality terapeutických monoklonálních protilátek (mAb). Man-5 ovlivňuje farmakokinetiku a clearance mAb, a proto vyžaduje rutinní monitorování s vysokým rozlišením a reprodukovatelností. Implementace principů Analytical Quality by Design (AQbD) poskytuje systematický přístup k optimalizaci chromatografických metod, zvyšuje robustnost a zkracuje čas vývoje nových analytických postupů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo adaptovat univerzální HILIC platformní metodu pro N-glykany na cílený fluorescenční detekční assay pro rutinní monitorování Man-5 pomocí AQbD přístupu. Studie využila Design of Experiments (DoE) a pokročilé statistické nástroje k identifikaci a optimalizaci kritických parametrů metody, vytvoření robustního Method Operable Design Region (MODR) a následnou verifikaci metodických podmínek.

Použitá metodika a instrumentace

Postup vývoje metody zahrnoval:

• Předběžné experimenty OFAT pro stanovení rozsahu podmínek (koncentrace amonného formiátu, teplota kolony, sklon gradientu).
• Vícevýběrový DoE s Fusion QbD Software pro modelování vlivu parametrů na USP half-height rozlišení Man-5 vs. koelujících glykanů FA1G1/A2G1.
• Optimalizace gradientu a přechod z kvaternárního (QSM) na binární (BSM) pumpovací modul pro snížení dwell volume a zkrácení runtime.
• Robustness Simulator™ pro výpočet Cpk ≥ 1,33 a určení MODR.
• Verifikační analýzy pěti bodů MODR (6× opakování) pro potvrzení výkonnosti a reproducibility.
  

Hlavní instrumentace:

• ACQUITY Premier System (HILIC UPLC)
• ACQUITY FLR Detector (λexc 265 nm / λemis 425 nm)
• ACQUITY QDa II Mass Detector (ESI+, 350–1500 m/z)
• Empower 3 CDS (verze 3.8.1)
• Fusion QbD Software (verze 9.9.2 SR3.b)

Hlavní výsledky a diskuse

DoE prokázalo, že kromě koncentrace pufru jsou klíčovými faktory také teplota kolony a sklon gradientu. První DoE identifikovalo podmínky s nejvyšším rozlišením (50 mM amonný formiát, 30 °C, 0,14 %/min). Druhý DoE optimalizoval délku a sklon gradientu za účelem zkrácení běhu metody, přičemž se udrželo požadované USP HH rozlišení ≥ 2,0. Robustness Simulator definoval MODR s Cpk ≥ 1,33, a pěti verifikačními body s nejkratšími runtime bylo potvrzeno splnění systémových kritérií a experimentální soulad s predikcemi Fusion QbD.

Přínosy a praktické využití metody

Nově vyvinutá metoda poskytuje:

• Vysoké rozlišení cílového Man-5 glykanu bez nutnosti masové detekce pro rutinní FLR analýzu.
• Enhanced robustness a shodu s regulatorními požadavky (ICH Q14).
• Efektivní datový tok díky integraci Empower 3 a Fusion QbD.
• Zkrácení doby analýzy až o polovinu ve srovnání s platformní metodou.

Budoucí trendy a možnosti využití

Budoucí vývoj v oblasti analytické chemie může zahrnovat:

• Další rozšíření AQbD přístupu na komplexnější sacharidové profily nebo nové biotechnologické produkty.
• Integraci umělé inteligence pro automatizované návrhy DoE a prediktivní modelování.
• Multiplexní detekční systémy kombinu­jící FLR, MS a fotometrické techniky pro rychlejší a citlivější analýzy.
• Miniaturizaci a vysokopropustné platformy pro simultánní screening glykoform.

Závěr

Implementace principů AQbD vedla k efektivní transformaci univerzální HILIC platformní metody na cílený, robustní a rychlý analytický postup pro monitorování Man-5 glykanu. Systematické využití DoE, Fusion QbD Software a specifických detektorů zaručilo vysoké rozlišení, reprodukovatelnost a shodu s regulačními standardy, což významně zkracuje čas vývoje a zlepšuje kvalitu dat.

Reference

1. Yu YQ. Released N-linked Glycan Analysis Using the Glycan Application Solution With UNIFI. Waters Application Note, 2016.
2. ICH Q14 Guideline on Analytical Procedure Development. ICH, November 2023.
3. McCall SA et al. Profiling Released High Mannose and Complex N-Glycan Structures from Monoclonal Antibodies Using RapiFluor-MS Labeling and Optimized HILIC. Waters Application Note, 2015.
4. Goetze AM et al. High-mannose Glycans on the Fc Region of Therapeutic IgG Antibodies Increase Serum Clearance in Humans. Glycobiology, 2011;21(7):949–959.
5. QbD-aligned LC Method Development with Fusion QbD. White Paper, S-Matrix Corporation, 2018.