Targeted LC-MS/MS detection of lipid impurities in lipid nanoparticles

Význam tématu

Analýza lipidových nanočástic (LNP) je klíčová pro vývoj mRNA vakcín a léčivých systémů. Kvalita lipidových složek přímo ovlivňuje stabilitu a účinnost mRNA, přičemž nežádoucí oxidace a degradace lipidů mohou vést ke snížení biologické aktivity. Robustní metoda pro detekci stopových nečistot přispívá k zajištění bezpečnosti a konzistence sérií.

Cíle a přehled studie

Cílem práce je prezentovat workflow pro cílenou detekci lipidových nečistot v LNP pomocí HPLC-MS/MS bez závislosti na standardech nečistot. Studie zahrnuje:

• optimalizaci MRM přechodů pro hlavní lipidy
• identifikaci a sledování predikovaných degradačních produktů
• aplikaci metody na prázdné i oligonukleotidy naložené LNP
• hodnocení stability nečistot v různých skladovacích podmínkách

Použitá metodika a instrumentace

Formulace LNP probíhala na KNAUER IJM NanoScaleru mícháním lipidové fáze s vodnou fází obsahující polyA při celkovém průtoku 6 ml/min a poměru organické:fáze 1:3. Separace proběhla na UHPLC systému AZURA® (pumpy P 8.1L, autosampler AS 6.1L, termostat CT 2.1) se sloupcem Kinetex® 1,7 µm phenyl-hexyl (2,1×50 mm) při 45 °C. Mobilní fáze obsahovala 5 mM acetátu amonného ve vodě (A) a směsi acetonitril:methanol:voda (66,5:28,5:5 v/v/v) s 5 mM acetátu (B). Detekce probíhala na hmotnostním spektrometru Sciex Triple Quad™ 5500+ v režimu ESI+ a ESI- s optimalizovanými parametry zdroje a MRM přechody pro lipidy DSPC, cholesterol, ALC-0159 a ionizovatelný lipid ALC-0315 a jejich degradáty.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila separaci a kvantifikaci čtyř hlavních lipidů v lineárním rozsahu s koeficienty determinace R2 > 0,99. Identifikovány byly predikované produkty ALC-0315: N-oxidace, ztráta akylového řetězce, ztráta CH2, karboxylace a ztráta hlavičky. DSPC degraduje na stearovou kyselinu, detekovanou režimem ESI-. Při aplikaci na prázdné a polyA-naložené LNP byla zjištěna 70–90% návratnost lipidů. Stabilitní studie ukázala nárůst ALC-0315 N-oxidu při pokojové teplotě, zejména v LNP obsahujících RNA, zatímco ostatní degradáty zůstaly relativně konstantní.

Přínosy a praktické využití metody

Nová workflow poskytuje flexibilní platformu pro rutinní QC formulací LNP:

• cílené sledování známých i neznámých degradátů bez potřeby standardů nečistot
• rychlé přidání dalších MRM přechodů pro objevené produkty
• spolehlivá detekce stopových oxidů ovlivňujících stabilitu mRNA

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda lze rozšířit o vysokorozlišující MS pro neznámé nečistoty a necílené screeningové analýzy. V dalším kroku je možné integrovat automatizovanou přípravu vzorků v linkách pro vysokoprocesní testování stability lipidových formulací a rozšířit ji o další typy lipidů v nových aplikacích.

Závěr

Prezentovaný HPLC-MS/MS přístup pro analýzu lipidových nečistot v LNP nabízí citlivé, kvantitativní a flexibilní řešení pro kvalitativní kontrolu. Umožňuje včas odhalit degradaci klíčových lipidů, což je nezbytné pro zajištění účinnosti a bezpečnosti mRNA vakcín a terapeutik.

Reference

• USP. Analytical Procedures for Quality of mRNA Vaccines and Therapeutics – Draft Guidelines. 3. vydání, 2024.
• Prüfer M., Greco G. High-throughput and sensitive HPLC analysis of lipids used in LNP formulations with evaporative light scattering detection. KNAUER AppNote VPH0078, 2024.
• Packer M. et al. mRNA-reactive lipid oxidation. Nat Commun 2021, 12.
• Yang Z. et al. Structural characterization of the cationic lipid component ALC-0315 and its impurities. Sciex AppNote MKT-26966-A, 2023.
• Birdsall R.E. et al. Detection of lipid aldehydes by derivatization. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2024, 1234.
• Han D. et al. Lipid Nanoparticle Analysis: Leveraging MS to Reduce Risk. Waters AppNote 720007716, 2022.
• Mousli Y. et al. Hydrolytic stability of PEGylated lipids. J Pharm Biomed Anal 2022, 220, 115011.