Method Development of Proteolysis Targeting Chimera (PROTAC) Compound ARV-825 Forced Degradation Sample Using the Systematic Screening Protocol

Význam tématu

Proteolysis Targeting Chimera (PROTAC) představují moderní třídu cílených léčiv, která po navázání na specifický protein spouští jeho degradaci. Studium nuceného rozkladu (forced degradation) nových farmaceutických sloučenin je zásadní pro určení jejich stability, předpokládané trvanlivosti a bezpečnosti degradantů. LC-MS analytika hraje klíčovou roli, protože kromě efektivního rozlišení produktů rozkladu poskytuje i přesnou hmotnostní identifikaci.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo navrhnout a optimalizovat stabilitně indikující analytickou metodu pro forced degradation vzorek PROTAC sloučeniny ARV-825 pomocí systematického screeningového protokolu. Studie zahrnovala přípravu degradovaných vzorků, výběr vhodných podmínek mobilní fáze a sorbentu, optimalizaci gradientu a ověření reprodukovatelnosti metodiky.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek ARV-825 (1 mg/mL) podstoupil degradaci za zvýšené teploty (70 °C) s přídavkem 1 N HCl, 1 N NaOH, peroxidu vodíku a kontrolní tepelnou zkouškou. Výsledné degradační produkty byly spojeny a analyzovány LC-MS s elektrosprejovou ionizací (ESI+). Použitý systém:

• ACQUITY UPLC H-Class Plus s Quaternary Solvent Manager a QDa Mass Detector
• Empower 3 pro řízení a zpracování dat
• Sorbenty MaxPeak Premier HPS: BEH C18, CSH Phenyl-Hexyl, HSS PFP, HSS T3, Shield RP18, BEH C18 AX
• Mobilní fáze: voda, acetonitril, methanol, 2% kyselina mravenčí, 200 mM hydroxid amonný
• Řízený gradient od 0 do 70 % organiky v závislosti na optimalizaci

Hlavní výsledky a diskuse

1) Krok 1 protokolu odhalil lepší retenci degradantů při nízkém pH (formiát) než při vysokém pH (hydroxid), hlavní vrchol ARV-825 zůstal stabilní.
2) Screening šestice sloupců ukázal nejlepší celkovou separaci raných i pozdních eluátů na HSS T3 s acetonitrilem.
3) Optimalizací počátečního gradientu (0 % organiky) a snížením koncového intervalu na 70 % organiky se zlepšila retence raných degradantů a zkrátila doba běhu z 10,3 na 8,4 min.
4) Komparace HPS MaxPeak hardware vs standardní nerez ukázala rozdíl v separaci: u standardního kovu docházelo ke koeluci a nestabilitě retence, HPS potlačuje sekundární interakce a zvyšuje reprodukovatelnost.

Přínosy a praktické využití metody

• Zrychlený vývoj metody díky systematickému protokolu
• Baseline rozlišení všech degradantů a hlavní vrchol ARV-825
• Vyšší opakovatelnost ploch vrcholů s MaxPeak Premier oproti konvenčním kolonkám
• Minimalizace rizika sekundárních interakcí s kovovým povrchem

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj PROTAC sloučenin a jejich povolení v klinické praxi si vyžádá spolehlivou charakterizaci stability a degradantů. Očekává se nasazení vysokopropustných platform, automatizace screeningu sorbentů a využití pokročilých povrchových úprav sloupců. Kombinace cílené degradace proteinu a robustních analytických nástrojů otevře nové možnosti v personalizované medicíně.

Závěr

Systematický screening za podpory MaxPeak Premier HPS technologie umožnil během dvou dnů vyvinout stabilitně indikující metodu pro forced degradation vzorek PROTAC ARV-825. Eliminace interakcí s kovovým povrchem zvýšila spolehlivost a minimalizovala riziko přepakování. Metoda je připravena pro validaci a rutinní QC analýzy.

Reference

1. He L, Chen C, Gao G et al. ARV-825-Induced BRD4 Protein Degradation as a Therapy for Thyroid Carcinoma. Aging (Albany NY). 2020;12(5):4547-4557.
2. Wu S et al. BRD4 PROTAC Degrader ARV-825 Inhibits T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia by Targeting Myc-Pathway Genes. Cancer Cell Int. 2021;21:230.
3. Li Z et al. PROTAC Bromodomain Inhibitor ARV-825 Displays Anti-Tumor Activity in Neuroblastoma by Repressing MYCN or C-Myc. Front Oncol. 2020;10:XXX.
4. Sun X et al. PROTACs: Great Opportunities for Academia and Industry. Signal Transduct Target Ther. 2019;4:64.
5. Liu Z et al. An Overview of PROTACs: A Promising Drug Discovery Paradigm. Mol Biomed. 2022;3:46.
6. Sakamoto KM et al. PROTACs: Chimeric Molecules That Target Proteins to the SCF Complex for Degradation. Proc Natl Acad Sci USA. 2001;98(15):8554-8559.
7. Delano M et al. Using Hybrid Organic-Inorganic Surface Technology to Mitigate Analyte Interactions with Metal Surfaces in UHPLC. Anal Chem. 2021;93(14):5773-5781.
8. Walter TH et al. Modifying the Metal Surfaces in HPLC Systems and Columns to Prevent Analyte Adsorption. LCGC Supplements. 2022;28-34.
9. Smith K, Rainville P. Utilization of MaxPeak HPS and Atlantis Premier BEH C18 AX to Increase LC-MS Sensitivity. Waters App Note. 2020.
10. Jung MC, Lauber MA. Demonstrating Improved Sensitivity and Dynamic Range with MaxPeak HPS: A Case Study on Nucleotides. Waters App Note. 2020.
11. Zabala G et al. Improved Reproducibility for Acetaminophen Assay USP Monograph Using MaxPeak Premier Columns. Waters App Note. 2023.
12. Boissel C et al. ACQUITY Premier Improves UPLC-MS Analysis of Deferoxamine. Waters App Note. 2021.
13. Maziarz M et al. Improving Effectiveness in Method Development by Using a Systematic Screening Protocol. Waters App Note. 2014.
14. Berthelette KD et al. Systematic Screening Protocol on ACQUITY ARC with UV and QDa Detection for Antibiotics. Waters App Note. 2021.
15. Berthelette KD et al. Systematic Screening Protocol and MaxPeak HPS for Deferoxamine Forced Degradation. Waters App Note. 2022.
16. Hong P, McConville P. A Complete Solution to Perform a Systematic Screening Protocol for LC Method Development. Waters White Paper. 2017.
17. Zelesky T et al. Pharmaceutical Forced Degradation Endpoints: A Scientific Rationale and Industry Perspective. J Pharm Sci. 2023;112(12):2948-2964.