Efficient Preparative Purification Workflow of Synthetic Peptide Using Analytical/Preparative Switching LC-MS System

Význam tématu

Peptidová léčiva patří mezi rychle se rozvíjející oblast biofarmacie díky své specifické struktuře a biologické aktivitě. Chemická syntéza peptidek umožňuje vyrábět molekuly s precizní sekvencí, avšak vyžaduje efektivní čisticí postupy s vysokou čistotou a výtěžností. Seamless workflow na jediné platformě spojuje vývoj analytických podmínek, škálování a preparativní purifikaci do integrovaného procesu, což šetří čas a zvyšuje reprodukovatelnost výsledků.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje kompletní postup od optimalizace analytických parametrů až po preparativní purifikaci syntetického peptidu parathormonu (1–34) v systému Nexera™ Prep/LH-40/LCMS-2050 pomocí softwaru LabSolutions™ MD. Hlavním cílem bylo:

• Rychle nalézt optimální gradient pro dostatečné oddělení peptidu od nečistot.
• Posoudit nosnost kolony a škálovat metodu z analytické do preparativní úrovně.
• Zajistit selektivní frakcionaci řízenou PDA a MS signálem s vysokou čistotou a výtěžností.

Použitá instrumentace

• Chromatograf Nexera™ Prep/LH-40 se dvěma cestami průtoku (analytickou a preparativní).
• Software LabSolutions™ MD pro automatizovanou přípravu a vyhodnocení gradientních běhů.
• Detekce PDA (220 nm) a MS (LCMS-2050, ESI pozitivní mód, sken m/z 500–2000, průtočné plyny N2).
• Kolony Shim-pack Scepter™ C18-120 (4,6 × 150 mm, 5 µm) pro analýzu a (20 × 150 mm, 5 µm) pro preparativu.
• Systém vstřikování s objemy 10–50 µL (analytika) a 1 mL (preparativa), smyčky a stříkačky 500 µL–5 mL.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace analytických podmínek odhalila, že nejlepší rozlišení parathormonu a nečistot bylo při gradientu 25 → 35 % organické fáze v 10 min. Při zvýšení vzorku až na 50 µL se separace nezhoršila, což potvrdilo možnost škálování do preparativního režimu. V preparativní fázi při průtoku 20 mL/min a objemu 1 mL byly pomocí PDA a MS triggeru selektivně zachyceny frakce obsahující cílový peptid. Purita frakcí dosáhla téměř 100 % (vyhodnoceno UV), výtěžnost byla kolem 98 %. Podobná úspěšnost byla potvrzena na standardním angiotensinu I (100 % purita, 97,9 % recovery).

Přínosy a praktické využití metody

• Integrované přepínání mezi analytikou a preparativou v jednom systému šetří čas a eliminuje manuální operace.
• LabSolutions MD umožňuje rychlé screenování až 125 kombinací gradientů a koncentrací pro optimalizaci separace.
• MS-řízená frakcionace zvyšuje selektivitu a minimalizuje přenos nečistot do konečného produktu.
• Metoda je vhodná pro chemicky syntetizované peptide, střední molekuly a projektově orientované výzkumné laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace umělé inteligence pro predikci optimálních chromatografických podmínek a automatické úpravy gradientu.
• Rozšíření workflow na větší biomolekuly (proteiny, antikonce) a konjugáty (ADC).
• Vyšší průtokové systémy pro kontinuální purifikaci a škálování do pilotních provozů.
• Nasazení nových stacionárních fází s vyšší selektivitou pro tištěné fáze a monolitické kolony.

Závěr

Prezentovaný postup dokládá, že seamless workflow na platformě Nexera™ Prep/LH-40/LCMS-2050 v kombinaci se softwarovým balíčkem LabSolutions™ MD umožňuje rychlou a spolehlivou purifikaci syntetických peptidů s vysokou čistotou a výtěžností. Automatizované optimalizace a MS-triggerovaná frakcionace značně zkracují dobu vývoje a zvyšují reprodukovatelnost.

Reference

1. Shimadzu Corporation. Seamless Purification Workflow from Analytical to Preparative in Single LC-MS System, Application News 01-00650-EN, Jun. 2024.
2. Shimadzu Corporation. High Purity Preparative Purification Enabled by UV/MS Trigger on LC-MS System, Application News 01-00651-EN, Jun. 2024.