Rapid monitoring of the purification process of oligonucleotide impurities using a benchtop MALDI-TOF MS system

Význam tématu

Oligonukleotidové terapie představují rychle rostoucí segment farmaceutického průmyslu díky své schopnosti specifické modulace genové exprese. Při výrobě těchto látek z pevné fáze vznikají různé sekvenčně příbuzné nečistoty, které je nutné efektivně odstraňovat a monitorovat in-line během purifikačního procesu. Rychlá a spolehlivá analýza nečistot je klíčová pro zajištění kvality a bezpečnosti konečného produktu.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout rychlou a reprodukovatelnou metodu profilování sekvenčních nečistot oligonukleotidu pomocí benchtop MALDI-TOF MS. Studie porovnala tradiční dávkovou iontově výměnnou chromatografii se kontinuálním MCSGP (Multi-column Solvent Gradient Purification) procesem a ověřila vhodnost dvouvrstvého postupu přípravy vzorku pro zvýšení kvantitativní spolehlivosti měření.

Použitá metodika a instrumentace

• Analyzovaný produkt: syntetický antisense oligonukleotid Model MOE-ASO 18 mer s plnou PS modifikací a 2’-MOE nukleotidy.
• Purifikace batch: jedno sloupcové iontově výměnné čištění s kritériem čistoty ≥ 93 % (BioPro IEX SmartSep Q, 20 µm, 100×5 mm, 20 mM Tris-HCl pH 8 + 3 M NaCl, 15–75 % B, 0,6 mL/min).
• Purifikace kontinuálně: MCSGP systém se dvěma kolonkami pro simultánní recirkulaci a separaci vedlejších frakcí.
• Příprava vzorku pro MALDI: dvouvrstvý postup spojující tenkou vrstvu matrixové vrstvy (THAP) a tradiční dried-droplet pro lepší homogenitu krystalů.
• MALDI-TOF MS: Shimadzu MALDI-8030, lineární režim, dvojsílařské detekční mody.
• Potvrzení prirazených nečistot: LC/MS/MS Q-TOF (LCMS-9050) a LabSolutions Insight Biologics verze 2.0.
• Datová analýza: PCA pomocí eMSTAT Solution pro hodnocení podílu jednotlivých krátkých oligomerů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Dvouvrstvý postup přípravy vzorku výrazně zlepšil opakovatelnost MALDI spekter a kvalitu kvantifikace relativních intenzit.
• Identifikováno bylo 15 hlavních krátkých oligomerů (N-1 až N-15) v syrovém produktu, z nichž většina byla během purifikace efektivně odstraněna.
• Batch purifikace dosáhla čistoty ≥ 93 % a MALDI profil odhalil postupné snižování krátkých nečistot.
• Kontinuální MCSGP proces vykázal stabilní profil impurit během deseti cyklů, což potvrzuje robustnost a opakovatelnost této technologie.
• PCA analýza ukázala jasné oddělení surového a purifikovaných vzorků na základě intenzit nečistot relativně k hlavnímu produktu (FLP).

Přínosy a praktické využití metody

Navržená MALDI-TOF MS metoda umožňuje rychlou (< 10 min) kontrolu impurit během výrobního procesu oligonukleotidů, čímž přispívá k minimalizaci časové náročnosti a nákladů. Díky vysoké reprodukovatelnosti lze metodu snadno implementovat do QA/QC workflow v biotechnologických a farmaceutických laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody na různé typy modifikovaných oligonukleotidů a RNA terapie.
• Integrace online MALDI-TOF MS pro automatizované in-line monitorování purifikace.
• Další zlepšení kvantitativní přesnosti pomocí interních standardů či isotopových značek.
• Využití pokročilé softwarové analýzy a strojového učení pro rychlejší interpretaci komplexních spekter.

Závěr

Studie prokázala, že benchtop MALDI-TOF MS ve spojení s optimalizovanou přípravou vzorku nabízí rychlý, citlivý a reprodukovatelný nástroj pro sledování purifikačního procesu oligonukleotidových terapií. Metoda je vhodná pro in-process kontrolu a může významně urychlit vývoj i výrobu oligonukleotidových léčiv.