Promix™ Columns - Two Dimensional Separation of Proteins & Peptides

Význam tématu

Analytická separace proteinů a peptidů je klíčová pro proteomické studie, biofarmaceutický výzkum a kvalitativní i kvantitativní kontrolu biopolymerů. Kombinace více chromatografických interakcí umožňuje rozlišení vysoce homologních biomolekul lišících se i jedinou aminokyselinou.

Cíle a přehled studie / článku

Článek představuje technologii Promix™, která propojuje iontovou výměnu a reverzní fázi v jedné kolóně pro dvourozměrnou separaci proteinů a peptidů. Cílem je demonstrovat zvýšenou rozlišovací schopnost, kapacitu a škálovatelnost této metody pomocí příkladů separace insulinových analogů, komplexních směsí peptidů i proteinových digesátů.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda využívá hybridní stacionární fázi s kombinovanými iontovými a hydrofobními interakcemi. Přehled instrumentace:

• Kolony Promix™ MP, SP, AP ve velikostech od kapilárních (50×3,0 mm) až po preparativní (250×4,6 mm).
• Mobilní fáze: gradienty acetonitrilu (MeCN) v rozmezí 0–70 % s přídavkem formiátu amonného, trifluoroctanu (TFA), fosforečnanu či jiných kyselin při pH 2,0–4,0.
• Detekce UV při vlnových délkách 210 nm a 270 nm.
• Průtok 1,0 ml/min, objem injekce 5–100 µl.

Hlavní výsledky a diskuse

Ukázalo se, že technologie Promix™:

• Umožňuje baseline separaci insulinových analogů lišících se jednou aminokyselinou s rozlišením kolem 1,2–1,7.
• Dokáže frakcionovat jak malé oligopeptidy (<1 kDa), tak větší peptidy (>5 kDa) a proteiny (13–29 kDa) ve dvou krocích pomocí různých kolón MP a SP.
• Pružně upravuje selektivitu volbou pufru (amonný formiát, acetát), jeho koncentrace a pH či typ přidané kyseliny (TFA, H3PO4, H2SO4, HClO4).
• Nabízí zvýšenou kapacitu a rozlišení oproti konvenční iontové výměně nebo reverzní fázi samostatně.

Přínosy a praktické využití metody

Hybridní Promix™ kolony jsou plně kompatibilní s LC-MS díky použití volitelných iontově párovaných i těkavých pufrů. Díky škálovatelnosti je možný přechod od analytických až po preparativní aplikace. Metoda nachází uplatnění v purifikaci rekombinantních proteinů, kvalitativní analýze peptidových knihoven a vývoji biofarmaceutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření automatizovaných gradientních protokolů kombinujících iontové a organické gradienty, integrace s vysokorychlostními a mikrofluidními systémy a rozvoj stacionárních fází s cílenou selektivitou pro modifikované peptidy či glykoproteiny. Dalším krokem je implementace do online proteomických workflow a vysokoúčinné frakcionace pro hromadné spektrální knjižnice.

Závěr

Technologie Promix™ poskytuje inovativní přístup k dvourozměrné chromatografii proteinů a peptidů, spojující iontové a hydrofobní interakce. Nabízí vynikající selektivitu, kapacitu a škálovatelnost pro široké spektrum aplikací v proteomice i biofarmaceutickém průmyslu.