COMPREHENSIVE DISCOVERY LIPIDOMIC WORKFLOW WHICH UTILIZES A NOVEL, MULTI-REFLECTING TOF WITH INTEGRATED INFORMATICS, PROVIDING HIGHLY CONFIDENT LIPID CHARACTERIZATION AND QUANTIFICATION

Význam tématu

Analýza lipidů je zásadní pro pochopení buněčných procesů, jako jsou energetické zásoby, signalizace a struktura membrán. Zvláště u nádorových onemocnění, například kolorektálního karcinomu, dochází k výrazným změnám lipidového profilu, jejichž přesná identifikace a kvantifikace může významně přispět k diagnostice a sledování onemocnění.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout integrovaný workflow pro objevnou lipidomiku, který kombinuje vysoce rozlišenou hmotnostní spektrometrii Xevo MRT s výkonným softwarovým prostředím Lipostar2. Testováno bylo na pilotní studii lidské plazmy od zdravých dárců a pacientů s kolorektálním karcinomem. Analýza proběhla v režimu datově nezávislé akvizice (DIA) a jejím výstupem byla identifikace dysregulovaných lipidových drah charakteristických pro nádorové onemocnění.

Použitá instrumentace

• ACQUITY Premier UPLC I-Class s kolonnou CSH C18 (2.1 × 100 mm, 1.7 μm)
• Xevo MRT (Multi-Reflecting QToF) se zdrojem ESI
• Platforma waters_connect pro řízení akvizice a export dat (mzML)
• Softwarové prostředí Lipostar2 pro výběr signálů, statistiku, identifikaci a analýzu drah

Použitá metodika

Reverzní fáze s 12minutovou gradientní separací a následujícími fázemi:

• Fáze A: acetonitril/voda (60:40) s 10 mM formiátu amonného a 0,1 % kyseliny formiové
• Fáze B: isopropanol/acetonitril (90:10) se stejnou adicí

Vzorky plazmy (25 μL) byly zpracovány precipitací proteinů isopropanolem obsahujícím interní standardní směs EquiSPLASH. Každý vzorek byl injikován náhodně v trojím opakování, QCs vkládány po šesti injekcích. Data akvizice probíhala při kontinuálním 10Hz skenování v režimu DIA.

Hlavní výsledky a diskuse

Supervidované PLS-DA modely pro srovnání zdravých kontrol a CRC vzorků prokázaly:

• Vysokou reprodukovatelnost QC vzorků, které se klastrově sdružily centrálně
• Jasné oddělení zdravých a nádorových profilů po odstranění QC
• Možnost rozlišení kolorektálního karcinomu podle anatomické lokace (kolon vs. rektum)

Identifikované lipidy, zejména ceramidy Cer(36:1) a lysofoscholiny (LPC), vykazovaly statisticky významné rozdíly (ANOVA T-test) mezi skupinami. Softwarová identifikace využila fragmentační pravidla s hodnocením důvěryhodnosti („traffic light“ systém), přičemž zelené skóre signalizuje nízkou odchylku přesné hmotnosti a kvalitní fragmentaci.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analýza (12min běh) s vysokým rozlišením (až 100 000 FWHM) a citlivostí
• Kompatibilita s rozsáhlými soubory vzorků díky stabilnímu detektoru a robustní akvizici 60 Gb/s
• Integrovaná softwarová pipeline usnadňující selekci, kvantifikaci a biologické interpretace lipidů
• Využití v preklinickém výzkumu i QA/QC v průmyslové analytice

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření schopností pro cílenou lipidomiku s vylepšenou kvantifikací na úrovni izotopových standardů, integrace umělé inteligence pro automatizovanou interpretaci komplexních dat a propojení s jinými „omics“ platformami pro multidisciplinární výzkum.

Závěr

Navržený workflow kombinuje výkonný Xevo MRT hmotnostní spektrometr s inteligentním softwarem Lipostar2 a poskytuje rychlou, přesnou a reprodukovatelnou analýzu lipidů v komplexních biologických vzorcích. Metoda podporuje objev biomarkerů a hlubší porozumění dysregulovaným metabolickým drahám u kolorektálního karcinomu.

Reference

1. Morgan et al. Gut. 2023;72:338–344. doi:10.1136/gutjnl-2022-327736
2. Isaac G. et al. Robust and Reproducible Reversed-Phase Lipid Profiling Method for Large Sample Sets. Waters Application Note 720006959; 2020.
3. Silva J.C. et al. Mol. Cell. Proteomics. 2006;5:144–156.
4. Geromanos S.J. et al. Proteomics. 2009;9:1683–1695.
5. Sarafian M.H. et al. Anal. Chem. 2014; DOI:10.1021/ac500317c.
6. Goracci L. et al. Anal. Chem. 2017;89(11):6257–6264. DOI:10.1021/acs.analchem.7b01259.
7. Alizadeh J. et al. Eur. J. Cell Biol. 2023;102(3):151337.
8. Sheridan M. & Ogretmen B. Cancers (Basel). 2021;13(10):2475.