Routine Targeted Metabolomic Panel Analysis from Untargeted Acquisition of Differing Mouse Plasma Populations

Význam tématu

Metabolomická analýza hraje klíčovou roli ve výzkumu biochemických drah, farmakologie a toxikologie. Data independent acquisition (DIA) umožňuje získat komplexní metabolitické profily bez nutnosti předběžného seznamu cílových látek. Retrospektivní těžba dat z neřízeného záznamu s využitím spolehlivých retenčních časů a fragmentačních informací zvyšuje jistotu identifikace a rozšiřuje možnosti aplikace v rutině i výzkumu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit end-to-end workflow pro rutinní screening metabolitů v plazmě myší s využitím DIA (All Ions) na platformě LC/Q-TOF. Autoři porovnali dvě populace myší (20 samců a 20 samic) a demonstrovali:

• možnost zpětné cílené analýzy neřízeně získaných dat
• efektivní screening rozsáhlých spektrálních knihoven
• identifikaci rozdílů mezi skupinami za použití statistické analýzy

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: 20 µl plazmy (20 samců, 20 samic) extrahované pomocí Captiva EMR-Lipid destiček v automatickém dávkovači.
Chromatografie: Agilent 1290 Infinity II Bio HPLC, kolona Poroshell 120 HILIC-Z (2,7 µm, 2,1 × 150 mm), teplota 15 °C, objem injekce 4 µl, průtok 0,4 ml/min, gradient od 90 % ACN na 10 %.
Hmotnostní spektrometrie: Revident LC/Q-TOF s AJS ionizací v pozitivním i negativním režimu, zdrojové parametry: teplota plynu 225 °C, 9 l/min; mlžící plyn 30 psi; teplota proužkového plynu 375 °C, proud 12 l/min; kapilární napětí 3000 V; nozzle 500 V.
Data acquisition: All Ions experiment při energiích 0, 10 a 40 V.
Software: MassHunter Quantitative Analysis 12.1, LC Screener Tool, ChemVista pro správu spektrálních knihoven.

Hlavní výsledky a diskuse

Screening rozsáhlé knihovny (522 metabolitů) přinesl:

• 128 jednoznačně přítomných sloučenin
• 101 potenciálně přítomnou (jedna odchylka z nastavených parametrů)
• 294 nepřítomných (dvě a více odchylek)

Reprodukovatelnost QC vzorků: průměrné RSD plochy 14 % (101 sloučenin <20 %), průměrné RSD retenčního času 0,81 %. Kvalita identifikace: 113 sloučenin s Mass Match Score >80 (průměr 93), průměrná přesnost hmotnosti –0,35 ppm.
Statistická analýza (MassHunter Explorer) odhalila 12 metabolitů s více než dvojnásobnou změnou a p-hodnotou <0,05 mezi samci a samicemi.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow nabízí:

• jednoduché nastavení a rutinní provoz v QA/QC i výzkumných laboratořích
• možnost zpětné analýzy bez omezení cílených seznamů
• zvýšenou jistotu díky fragmentačním datům z DIA
• identifikaci statisíců datových bodů v jedné analýze

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj spektrálních knihoven s třetími stranami, integrace strojového učení pro automatizované vyhodnocení a rozšíření workflow na lipidomiku a další biologické matrice. Vyšší propustnost a plná automatizace umožní rozsáhlé klinické a toxikologické studie.

Závěr

Ukázaný postup kombinuje výhody untargeted akvizice s cílenou těžbou dat, poskytuje vysokou reproducebilitu a jistotu identifikace metabolitů v komplexních vzorcích. Platforma Revident LC/Q-TOF a softwarové nástroje MassHunter představují robustní řešení pro rutinní metabolomickou analýzu.

Reference

1 Yannell, K. E. et al. An End-to-End Targeted Metabolomics Workflow. Agilent Application Note 5994-5628EN, 2023.
2 Yannell, K. E. et al. A Comprehensive Untargeted Metabolomics LC/Q-TOF Workflow with an Unknowns Identification Strategy to Identify Plasma Metabolite Shifts in a Mouse Model. ASMS, 2022.